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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2141 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die begrenzte Vielfalt an Zielen verfügbarer Antibiotikatherapien hat einen enormen Druck auf die Behandlung bakterieller Krankheitserreger ausgeübt, bei denen zahlreiche Resistenzmechanismen, die ihrer Funktion entgegenwirken, zunehmend vorherrschen. Hier verwenden wir ein unkonventionelles Antivirulenz-Screening von Wirt-Gast-interagierenden Makrozyklen und identifizieren einen wasserlöslichen synthetischen Makrozyklus, Pillar[5]aren, der nicht bakterizid/bakteriostatisch ist und über einen Wirkmechanismus verfügt, der die Bindung an beide beinhaltet Homoserinlactone und Lipopolysaccharide, wichtige Virulenzfaktoren bei gramnegativen Krankheitserregern. Pillar[5]aren ist aktiv gegen die Carbapenem- und Cephalosporin-resistenten Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii der dritten/vierten Generation, unterdrückt Toxine und Biofilme und erhöht die Penetration und Wirksamkeit von Standardantibiotika bei kombinierter Verabreichung. Die Bindung von Homoserinlactonen und Lipopolysacchariden bindet auch deren direkte Wirkung als Toxine auf eukaryotische Membranen und neutralisiert wichtige Werkzeuge, die die bakterielle Besiedlung fördern und die Immunabwehr sowohl in vitro als auch in vivo behindern. Pillar[5]aren umgeht sowohl bestehende Antibiotikaresistenzmechanismen als auch den Aufbau einer schnellen Toleranz/Resistenz. Die Vielseitigkeit der makrozyklischen Wirt-Gast-Chemie bietet zahlreiche Strategien für die gezielte Bekämpfung der Virulenz bei einem breiten Spektrum gramnegativer Infektionskrankheiten.

Der Umfang der derzeitigen Angriffsziele von Antibiotika ist sehr begrenzt, da die überwiegende Mehrheit der zugelassenen Behandlungen entweder auf die DNA-Synthese, die Proteinsynthese, die Membranintegrität oder die Zellwandbiosynthese abzielt, denen alle durch zahlreiche und immer häufiger auftretende Resistenzmechanismen entgegengewirkt werden. Die daraus resultierende drohende globale Gesundheitskrise wurde in jüngsten Berichten aus verschiedenen Perspektiven dokumentiert1,2,3 und hat die Weltgesundheitsorganisation dazu veranlasst, eine Liste mit prioritären Krankheitserregern zu erstellen. Gramnegative Bakterien, deren äußere Membran (OM) als starke Barriere gegen eine große Anzahl von Standardantibiotika fungiert, stellen neben Carbapenem-resistenten Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa die Mehrheit der Krankheitserreger auf der Prioritätenliste4 unter den Top5 vertreten. Diese drängende globale Herausforderung unterstreicht die Notwendigkeit der Entdeckung von Therapien mit einzigartigen molekularen Gerüsten und/oder Wirkmechanismen, die bestehende Resistenzmechanismen umgehen und weniger wahrscheinlich zu Arzneimittelresistenzen führen6.

Eine vielversprechende Alternative zum begrenzten Anwendungsbereich von Antibiotika ist die gezielte Bekämpfung bakterieller Virulenzfaktoren, die eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Infektionen spielen6. Mögliche Ziele waren porenbildende Toxine7, Homoserinlacton-Signalmoleküle8,9,10, bakterielle Biofilme11,12, Metallchelatbildung13 und das bakterielle OM14. Makrozyklische Hohlräume enthaltende Moleküle werden aufgrund ihrer einstellbaren molekularen Präferenzen von supramolekularen Chemikern intensiv in der Wirt-Gast-Chemie erforscht. Insbesondere ermöglichen unterschiedliche sterische und konformative Präferenzen die unterschiedliche Einkapselung bestimmter Gäste in ihren inneren Hohlräumen15. Die Kernstruktur kann auch leicht mit funktionellen Gruppen modifiziert oder erweitert werden, um sekundäre Funktionalitäten hinzuzufügen16, wobei mehrere Beispiele für gleichzeitig stattfindende Wechselwirkungen bekannt sind17,18. Jüngste Bemühungen haben auch die Anwendung funktionalisierter Makrozyklen für antibakterielle Therapien sowohl für grampositive19 als auch für gramnegative20 Krankheitserreger untersucht, einschließlich Biofilm-Targeting-Verbindungen21. Der Zusammenhang zwischen Struktur, Funktion und Wirkmechanismus ist jedoch noch immer kaum verstanden.

Homoserinlactone (HSLs) sind kleine diffundierbare Signalmoleküle, die von gramnegativen Bakterien in einem Prozess namens Quorum Sensing (QS) produziert, freigesetzt und wahrgenommen werden. Sie werden zur Koordinierung kolonieweiter Reaktionen einschließlich Biofilmbildung, Produktion von Exotoxinen und Tensiden sowie Motilität verwendet und Nährstofffängermoleküle22,23. Als solche stellen sie ein attraktives Ziel für Antivirulenzstrategien dar und wurden bereits zuvor als solche erforscht24,25. Lipopolysaccharide (LPS) bilden einen Hauptbestandteil der äußeren Packungsbeilage des OM in gramnegativen Bakterien und stellen eine starke Barriere gegen intrazelluläre Antibiotika dar26.

In dieser Arbeit untersuchen wir die Wechselwirkungen zwischen dem synthetischen Makrozyklus Pillar[5]aren (P[5]a) und zwei unterschiedlichen Virulenzfaktoren: HSLs und LPS. Wir untersuchen die Wechselwirkung zwischen P[5]a und HSLs und wie diese virulenzkontrollierte Reaktionen bei bakteriellen Krankheitserregern unterbindet. Ebenso untersuchen wir die Wechselwirkungen zwischen P[5]a und LPS und wie sich dies auf die Funktion von LPS in der Außenmembran auswirkt, was zu einer erhöhten Penetration von Antibiotika durch die OM-Barriere führt. Gemeinsam untersuchen wir, wie P[5]a die bakterielle Virulenz in weitgehend arzneimittelresistenten Isolaten unterdrückt und beobachten, dass sich die Lebensfähigkeit von Lungenepithelzellen in Abwesenheit von Virulenzfaktoren dramatisch erholt. Die kombinierten Wechselwirkungen von P[5]a mit bakteriellen Virulenzfaktoren stellen eine vielversprechende Strategie gegen antibiotikaresistente Infektionen dar, entweder allein oder in Kombination mit Standardantibiotika.

Um mögliche Wirt-Gast-Wechselwirkungen zwischen hohlraumhaltigen Makrozyklen und bakteriellen Signalmolekülen zu identifizieren, haben wir ein unkonventionelles Screening einer Reihe von Makrozyklen (Ergänzungstabelle 1) auf Affinität zu sechs verschiedenen HSLs durchgeführt (Abb. 1a, b). Obwohl in früheren Versuchen bereits ein Zusammenhang zwischen der Größe des inneren Hohlraums und der Bindungsaffinität festgestellt wurde9, ist wenig über die Affinitäten, Präferenzen und Determinanten der Wirt-Gast-Interaktionen mit HSLs bekannt. Um ein besseres Verständnis zu erlangen und davon auszugehen, dass ihre Hohlraumgröße eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der HSL-Affinität spielt, wurden sehr unterschiedliche Arten von Makrocyclen ausgewählt, hauptsächlich um einen vielfältigen Bereich an inneren Hohlraumgrößen (1,5 – 11,7 Å) und Molekulargewichten (172) darzustellen – 2.260 g/mol). In ähnlicher Weise wurden HSLs ausgewählt, um Diversität in ihren Acylketten darzustellen, einschließlich eines verzweigten Kohlenstoffs, Carboxylgruppen und Hydroxylgruppen. Wir untersuchten auch die Bindung an pC HSL, das ein terminales Paraphenol enthält.

ein Schema der Interaktion zwischen makrozyklischen „Wirten“ und HSL-„Gästen“. b Die molekularen Strukturen, abgekürzten Namen und Bakterienarten aller in dieser Studie verwendeten QS-HSLs. c Schematische Darstellung des HSL-Quorum-Sensings in gramnegativen Bakterien (links) zusammen mit einem Ansatz zur Virulenzhemmung (rechts). Kurz gesagt, von ausgewählten Individuen produzierte HSLs diffundieren frei durch die äußeren und inneren Membranen und werden von intrazellulären Rezeptorproteinen in anderen Gemeinschaftsmitgliedern wahrgenommen, was die Produktion von isogenem HSL und eine synchronisierte Regulierung von Aktivitäten fördert. Angewandte Virulenzhemmungsstrategie, bei der die Interaktion zwischen den HSLs und dem makrozyklischen Wirt die Erkennung von HSLs durch seinen zugehörigen Rezeptor verhindert. d Das Screening auf die Wechselwirkung zwischen HSLs wie in (b) und einer Reihe von Makrozyklen zeigt mehrere Kombinationen, bei denen der Makrozyklus mit den HSL interagiert und bei denen die Wachstumsrate in E. coli (I1/I0 OD600) größtenteils unbeeinflusst bleibt (Schwellenwert, grau). gestrichelte Linien, ±20 %). Die Interaktion wird durch einen HSL-Biosensor nachgewiesen, wo der entsprechende Rezeptor exprimiert wird und die Promotor-Bindungsregion an GFP fusioniert wird. Wechselwirkungen zwischen Makrozyklen und HSLs werden durch eine Abnahme der Affinität (I1/I0) beobachtet. e Konzentrationsabhängige Effekte des am stärksten interagierenden Makrozyklus, P[5]a, auf die Fluoreszenzexpression in E. coli für jedes der sechs HSLs weisen auf eine erhöhte Affinität zu HSLs mit längeren Acylketten hin. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe). f Einfluss von P[5]a auf die Wachstumsrate und Lebensfähigkeit von E. coli. E. coli, inkubiert mit der höchsten getesteten Konzentration von P[5]a, 2,5 mM, zeigt eine Standard-Wachstumskurve, einschließlich Lag, Log und stationäre Phase. Eine BacLight-Bewertung der bakteriellen Lebensfähigkeit zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen in allen getesteten Konzentrationen von P[5]a nach 24-stündiger Exposition und keinen konzentrationsabhängigen Zelltod. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe).

Für das Screening haben wir ein fluoreszierendes E. coli-Reportersystem entwickelt, das die sechs verschiedenen HSLs erkennen kann. Jeder Rezeptor dimerisiert und bindet an den mit EGFP verknüpften Promotor bei Zugabe seines zugehörigen HSL (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1, ergänzende Tabelle 2). Wir suchten nach makrozyklischen Virulenzinhibitoren mit einem starken Signalverhältnis für jedes der HSLs (I1/I0-Fluoreszenz) und minimalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und Wachstumsrate der Bakterien (optische I1/I0-Dichte, ± 20 %, graue gestrichelte Linien). Wir haben mehrere interessante Makrozyklus-HSL-Kombinationen mit einem Fluoreszenzsignalverhältnis von über 50 % und minimalen Auswirkungen auf die Wachstumsrate identifiziert, die in blauen Kreisen hervorgehoben sind (Abb. 1d, ergänzende Abb. 1a-e). Alle Wirt-Gast-Kombinationen mit erhöhter Bindung fallen in einen begrenzten Bereich der inneren Hohlraumgrößen, von 3 Å für 4-Sulfocalix[4]aren (4-Sc[4]a) bis 7,8 Å für β-Cyclodextrin (β-CD). ), was darauf hindeutet, dass der innere Hohlraum eine Rolle bei der Bindung spielt. Unter den getesteten Makrozyklen zeigte P[5]a das höchste konzentrationsabhängige Signalverhältnis. Obwohl P[5]a eine Bindung mit allen sechs HSLs zeigt, reicht die Bandbreite von fast keiner Bindung an die C4-HSL (18 %) mit einer sehr kurzen Acylkette bis zu einer starken Bindung an die 3-Oxo-C12 (64 %). und 3:OH:C14 HSL (96 %), beide mit verlängerten Acylketten (Abb. 1e).

P[5]a hatte keinen erkennbaren Einfluss auf die Wachstumsrate in E. coli und eine Lebensfähigkeitsbewertung nach 24-stündigem Wachstum zeigt, dass alle getesteten Konzentrationen (bis zu 2,5 mM) gut vertragen wurden (Abb. 1f, ergänzende Abb. 2a-e). ). Eine genauere Betrachtung der Struktur von P[5]a (Abb. 2a) zeigt, dass es sich um ein modifiziertes Pillar[5]aren mit einem lipophilen Kern und einer hydrophilen Peripherie handelt. Es enthält einen hydrophoben Hohlraum (4,6 Å) und einen symmetrisch substituierten polykationischen Rand. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrieanalyse zeigen, dass P[5]a in einer kombinierten mikrobiellen Gemeinschaft, bestehend aus vier E. coli-Sensorstämmen mit jeweils einem einzigartigen fluoreszierenden Protein, das ein anderes HSL erkennt, selektiv das 3-OH-C14:1-HSL bindet mit einer verlängerten Acylkette, was zu einer 102-Reduzierung der Fluoreszenz des pCin-EGFP-Sensorstamms führt (Abb. 2b-d). Im Gegensatz dazu blieb die Expression der anderen drei Sensorstämme durch die Zugabe von P[5]a weitgehend unbeeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Wirt-Gast-Wechselwirkungen für das spezifische Targeting von Bakterien mit längeren Acylketten genutzt werden könnten. Die von uns vorgeschlagene Selektivität kann ein vorteilhafter Ansatz sein, um Krankheitserreger im Vergleich zur Breitbandantibiotikaaktivität gezielter zu bekämpfen. In verschiedenen Umgebungen, beispielsweise im menschlichen Mikrobiom, ist eine vielfältige mikrobielle Darmgemeinschaft für die Gesundheit ihres Wirts von entscheidender Bedeutung. Eine Antibiotikabehandlung kann sich nachteilig auf die Vielfalt des Mikrobioms auswirken, die allgemeine Gesundheit des Wirts verschlechtern und ihn gleichzeitig weitaus anfälliger für Infektionen mit Clostridium difficile machen.

a Chemische Struktur des synthetischen Wirts P[5]a, der die stärkste Wechselwirkung mit HSLs mit längeren Acylketten zeigte, wobei der hydrophobe Kernhohlraum (brauner Kasten) hervorgehoben ist, der auf beiden Seiten von den polykationischen hydrophilen Resten (orangefarbener Kasten) flankiert wird. b Schematische Darstellung einer kombinierten mikrobiellen Gemeinschaft, in der P[5]a spezifisch Stämme hemmt, die HSLs mit längeren Acylketten zur Kommunikation und Synchronisation nutzen, wie in (c) und (d) zu sehen ist. c Fluoreszenzmikroskopische Bilder einer kombinierten mikrobiellen Gemeinschaft von E. coli-Zellen, bestehend aus vier verschiedenen Stämmen mit einem einzigartigen fluoreszierenden Protein (pRhl-mKO2 orange für C4, pLux-CFP cyan für 3-oxo-C6, pCin-GFP grün für 3- OH-C14:1 und pRpa-mCherry red für pC HSL), die jeweils ein anderes HSL erkennen, zeigen, dass P[5]a spezifisch und bevorzugt mit HSLs interagiert, die längere Acylketten enthalten. Die Zugabe von P[5]a führt zur Hemmung des pCin-GFP, wodurch die langkettige 3-OH-C14:1-HSL erkannt wird. Bilder repräsentativ für Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung (n = 3 pro Gruppe). Maßstabsbalken, 50 µm. d Durchflusszytometrieanalyse der kombinierten mikrobiellen Kultur in (i), die die spezifische Hemmung von pCin-GFP (Erkennung des 3-OH-C14:1-HSL) bei Zugabe von P[5]a bestätigt, angezeigt durch den schwarzen Pfeil. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde ein Versatz in der Y-Achse hinzugefügt. e P[5]a unterdrückt das Bakterientoxin Pyocyanin, ein Schlüsseltoxin in P. aeruginosa, das durch HSL-Quorum-Sensing kontrolliert wird, in PAO1 nach einer 24-stündigen Rührkultur. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 4 pro Gruppe). f P[5]a unterdrückt die Bildung von Biofilm in PAO1 nach einer 24-stündigen statischen Kultur. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe). g P[5]a unterdrückt die Biofilmbildung in klinischen „Superbug“-MDR-Isolaten von P. aeruginosa nach einer 24-stündigen statischen Kultur. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe). h P[5]a unterdrückt die Biofilmbildung in klinischen „Superbug“-MDR-Isolaten von A. baumannii nach einer 72-stündigen statischen Kultur. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe).

Um die möglichen Auswirkungen der Wirt-Gast-Wechselwirkungen zwischen den Makrozyklen und HSLs in einem biologischen Kontext zu verstehen, haben wir die Validierung anhand der klinisch relevanten P. aeruginosa und A. baumannii fortgesetzt, die beide langkettige HSLs einsetzen (Abb. 2b). Umfangreiche frühere Arbeiten zu diesen Krankheitserregern haben die Funktion von HSLs bei QS aufgeklärt, einem wesentlichen Regulierungsmechanismus der kollektiven Virulenz bei diesen Krankheitserregern27,28,29. Wir haben die Makrozyklen, die die höchste Affinität zeigten (d. h. P[5]a, α-Cyclodextrin (α-CD), β-CD und 4-Sc[4]a), auf ihre Auswirkungen auf die Produktion von Pyocyanin untersucht P. aeruginosa-Isolat PAO1. Pyocyanin ist ein Exotoxin mit einer erkennbaren kräftigen grünen Farbe, das direkt von QS reguliert wird und als Ersatzmaß für Virulenz dient (Abb. 2e). Die Zugabe von P[5]a führte zu einer konzentrationsabhängigen Verringerung der Pyocyaninspiegel, beginnend bei P[5]a-Konzentrationen von nur 10 µM, mit vollständiger Unterdrückung bei 1 mM und mehr. Im Gegensatz dazu hatten die Makrozyklen α-CD, β-CD und 4-Sc[4]a keinen Einfluss auf den Pyocyaninspiegel (ergänzende Abbildung 3a-c). Die Inkubation von Makrozyklen mit gereinigtem Pyocyanin bestätigt, dass P[5]a die Produktion von Pyocyanin hemmt, anstatt mit vorhandenen Toxinmolekülen zu interagieren (ergänzende Abbildung 3d). Die konzentrationsabhängigen Auswirkungen von P[5]a auf die Pyocyaninproduktion in PAO1 korrelieren stark mit den Auswirkungen von P[5]a auf den Quorum-Sensing-Biosensor in E. coli (ergänzende Abbildung 3e).

P[5]a hatte vergleichbare Auswirkungen auf die Biofilmbildung in PAO1, die ebenfalls stark mit HSL-reguliertem QS assoziiert sind, wie durch die violette Färbung (Kristallviolett) angezeigt wird, mit einer ähnlichen Konzentrationsabhängigkeit wie bei der Pyocyanin-Bewertung (Abb. 2f). . Aufgrund des zunehmenden Resistenzdrucks auf die Antibiotikatherapie haben wir die Wirksamkeit gegen Carbapenem- und Cephalosporin-resistente Pseudomonas aeruginosa- und Acinetobacter baumannii-Isolate der dritten/vierten Generation mit höchster Priorität getestet (Abb. 2g, h und ergänzende Daten 1). In allen Fällen beobachteten wir einen statistisch signifikanten Rückgang der Biofilmbildung. Die Wirksamkeit von P[5]a gegen die Stämme P. aeruginosa 2798 und A. baumannii 5542, 5707 und 5568 (Abb. 2g, h) ist von besonderer Bedeutung, da diese „Superbug“-Erreger gegen fast alle klinischen Behandlungen resistent sind (Supplementary). Daten 1).

Um zu bestätigen, dass die beobachteten Virulenzhemmungsreaktionen ein Ergebnis der Wechselwirkungen zwischen P[5]a und den HSLs innerhalb der Kernhöhle sind, und um die beobachteten Präferenzen für langverzweigte HSLs zu klären, verwendeten wir einen Farbstoffverdrängungstest ( Abb. 3a)30. Die Bindung von Methylenorange (MO) an P[5]a führt zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 470 nm auf 392 nm, wie berichtet (Abb. 3b, links)18,31. Die anschließende Zugabe von HSLs setzt das MO durch Konkurrenz frei Bindung (Abb. 3b, rechts). Die daraus resultierende Wiederherstellung der MO-Absorption bei 470 nm ermöglicht die Bestimmung der Bindungsaffinität von HSL-P[5]a (ergänzende Abbildung 4a-c).

a Schematische Darstellung des Farbstoffverdrängungstests mit Darstellung der gezielten P[5]a-HSL-Wechselwirkung (k1), der P[5]a-MO-Komplexbildung (k2) und des gemessenen Farbstoffverdrängungstests (k3). b Links: Verschiebung der Absorptionsspektren von MO (2,0 µM), titriert mit zunehmenden Mengen an P[5]a (dh k2). Rechts: Die Titration zunehmender Mengen an 3-Oxo-C12 HSL verdrängt das MO im Hohlraum von P[5]a, was zu einer Wiederherstellung des Absorptionsspektrums (dh k3) führt. c Gemessene optische Dichte bei 470 nm von P[5]a-MO-Komplexen (P[5]a-Konzentration = 10 µM, MO-Konzentration = 2,0 µM, NaCl-Konzentration = 50 mM), titriert gegen steigende Konzentrationen des entsprechenden HSL (Punkte). ). Die Daten stellen Durchschnittswerte ± SD dar (n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe). d Links: Absorptionsspektren von MO (2,0 μM), titriert mit steigenden Mengen an P[5]a (k2) in 0 und 50 mM NaCl. Rechts: Absorptionsspektren des P[5]a-MO-Komplexes, titriert mit den HSLs 3-Oxo-C8 und 3-Oxo-C12 (k3) in 0 und 50 mM NaCl. Die Daten stellen Durchschnittswerte ± SD dar (n = 3 biologisch unabhängige Proben pro Gruppe). Pfeile geben das P[5]a/MO-Verhältnis an, das für jede HSL-Titration ausgewählt wurde (1:1 bzw. 5:1). e NMR-Spektren (D2O/[D6]DMSO 30 % bei 310 K) von P[5]a, den HSLs 3-OH-C14:1, 3-Oxo-C12, 3-Oxo-C6 und C4 und P[ 5]a kombiniert mit jedem HSL. f Die Elektronendichte der kombinierten Oberfläche von P[5]a, komplexiert mit 3-OH-C14:1-, 3-Oxo-C12- und 3-Oxo-C6-HSLs. g Hydrophobe/phile Karten zeigen die Form und Ausdehnung der hydrophilen und hydrophoben Oberflächen von P[5]a isoliert sowie in 3-OH-C14:1, 3-Oxo-C12 und 3-Oxo-C6. h Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) gegen KEGG- und GO-Gensätze, durchgeführt an sequenzierter mRNA von PAO1, behandelt mit P[5]a. i Lokalisierung von mRNA-Produkten. Die Anzahl der mRNA-Produkte pro Lokalisierungsgruppe reicht vom Zytoplasma bis zum Periplasma: 27, 93, 17, 16, 16 bzw. 12. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quantile (Box) und den Bereich der Daten (Whisker).

Die Dissoziationskonstante (kD) zwischen P[5]a und den HSLs wurde bestimmt, was es uns ermöglichte, die Bindungsaffinität der HSLs in den P[5]a-Hohlraum einzustufen (3OH-C14:1 ≥ 3-oxo-C12 > 3- oxo-C8»3-oxo-C6~pC~C4) (Abb. 3c, Tabelle 1, ergänzende Abb. 5). Dies steht im Einklang mit der Abnahme der Hydrophobie, die aufgrund der Abnahme der Acylkettenlänge erwartet wird, wie in Abb. 1e beobachtet. Die Zugabe von NaCl beeinflusste die Assoziationskonstanten zwischen MO und P[5]a, wohingegen die Dissoziationskonstanten zwischen P[5]a und den HSLs unberührt blieben (Abb. 3c, Tabelle 1, ergänzende Abb. 6c). Dies legt nahe, dass elektrostatische Wechselwirkungen keinen Einfluss auf die Bindung von Gästen im Kernhohlraum haben.

Um besser zu verstehen, welche chemischen Wechselwirkungen beteiligt sind und wie Strukturmerkmale die Bindungspräferenzen beeinflussen, haben wir NMR verwendet (Abb. 3e). Die 1H-NMR-Ergebnisse bestätigen die stärkere Wechselwirkung mit den längeren 3-Oxo-C12- und 3-OH-C14:1-HSLs und bestätigen somit die Komplexierung. In C4- und pC-HSLs wurden in Gegenwart von P[5]a minimale Veränderungen beobachtet, was auf eine schwache bis keine Wechselwirkung hindeutet (Abb. 3e, ergänzende Abb. 6).

Wir verwendeten die Modellierung der Dichtefunktionaltheorie (M06-2X)32, um die HSL-P[5]a-Wechselwirkung zu visualisieren (Abb. 3f). Die gesamten Bindungsoberflächen waren im Allgemeinen proportional zur Affinität. Der große Unterschied im Alkylkettenvolumen zwischen 3-Oxo-C12 und 3-Oxo-C6 (70,5 vs. 6,3 Å) korrelierte mit ihrer relativen Affinität. Die lange hydrophobe Kette 3-Oxo-C12 befindet sich im inneren Hohlraum von P[5]a, was diesen Komplex zum stabilsten macht (ergänzende Abbildung 7a, b). Darüber hinaus zeigten diese HSL kaum oder gar keine Störungen der bevorzugten Geometrie oder Elektronik des Wirtshohlraums, was die Komplementarität hervorhebt (Abb. 3g, ergänzende Abb. 8). Bemerkenswert ist, dass das Vorhandensein von Carboxyl- oder Hydroxylgruppen oder das Fehlen funktioneller Gruppen keinen Einfluss auf die Bindungsaffinitäten hatte, abgesehen von der Beeinflussung der Länge der Acylkette. Dies weist weiter darauf hin, dass die Bindungsaffinitäten weitgehend von der Länge und Hydrophobie der Acylkettenlänge bestimmt werden.

Als nächstes analysierten wir die unterschiedliche Transkription der Gesamt-mRNA in P[5]a-behandeltem und unbehandeltem PAO1, um mehr Einblick in die Wirkungsweise zu gewinnen (Abb. 3h). Die Gen-Set-Anreicherung unter Verwendung der Begriffe Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) und Gene Ontology (GO) ergab eine starke Herunterregulierung virulenzassoziierter Faktoren, einschließlich Biofilmbildung, QS und Pyoverdin-Biosynthese. Die Lokalisierung der Proteinprodukte zeigt die größte Herunterregulierung bei Produkten, die auf den extrazellulären Raum und OM-Vesikel abzielen, die beide stark mit virulenten Faktoren in P. aeruginosa assoziiert sind, einschließlich LPS, Exotoxinen, Proteasen und Elastasen sowie essentiellen Komponenten im Frühstadium von Infektionen und deren Verlauf (Abb. 3i)33. Wir beobachteten auch eine Hochregulierung in Zweikomponentensystemen, integralen Membrankomponenten und Membrangensätzen, was auf ein Zusammenspiel von Effekten hinweist, die durch P[5]a an der OM-Oberfläche verursacht werden. Dies steht im Einklang mit früheren Charakterisierungen kationischer Verbindungen und Peptide, bei denen angenommen wird, dass die positiv geladenen Reste mit negativ geladenen Lipiden interagieren34,35.

Angesichts der Auswirkungen von P[5]a auf die Bakterienmembran (Abb. 3h, i) und seiner positiven Nettoladung vermuteten wir eine mögliche Wechselwirkung mit LPS. LPS ist eine Schlüsselkomponente im bakteriellen OM, dessen Phosphatgruppen zur gesamten negativen Ladung der Membranoberfläche beitragen. Dynamische Lichtstreuung (DLS) zeigt, dass die Titration von gereinigtem LPS mit steigenden Konzentrationen von P[5]a in Wasser zur Bildung größerer Komplexe führt, beginnend bei 15 µM und einem Plateau bei 40 µM (Abb. 4a). Die Titration dieser Komplexe in Wasser mit NaCl kehrt die größeren Komplexe um und bricht sie auf, was bestätigt, dass Oberflächenladungswechselwirkungen eine treibende Kraft bei der Komplexierung sind (Abb. 4b, c)36. Da die meisten physiologischen Bedingungen jedoch bei relativ hohen Salzkonzentrationen auftreten, die die Wechselwirkungen der Oberflächenladung behindern, haben wir die Titration von LPS mit P[5]a in physiologischen Salzpuffern 0,5x und 1x PBS untersucht. Ab 50 µM in 0,5x und 1x PBS beobachteten wir einen kontinuierlichen Anstieg der Anwesenheit großer Komplexe. Wir haben die P[5]a-LPS-Wechselwirkung in Umgebungen mit hohem Salzgehalt (1x PBS) mithilfe der analytischen Ultrazentrifugation (AUC) weiter untersucht, um die gebildeten Komplexe besser zu verstehen (Abb. 4d). P[5]a und LPS erforderten jeweils hohe Rotationsgeschwindigkeiten von 60.000 U/min, um eine nachweisbare Sedimentation zu erreichen. P[5]a-LPS-Mischungen führten zu einer schnellen Sedimentation bei Geschwindigkeiten von nur 25.000 U/min, was auf die Bildung größerer Komplexe/Aggregate schließen lässt (ergänzende Abbildung 9a – c). P[5]a-LPS-Mischungen zeigten deutliche Unterschiede in der Sedimentationsgeschwindigkeit dieser Komplexe, wie aus dem Sedimentationskoeffizientenbereich von 3–100 S hervorgeht. Dieser Bereich entspricht Molekulargewichten im Bereich von 5 × 103 bis 1 × 106 Da.

a P[5]a, titriert in 0,1 mg/ml PA10 LPS (5–10 µM) Lösung in Wasser mit DLS, zeigt die Bildung und Anordnung großer Komplexe ab 15 µM P[5]a. Die Daten stellen Durchschnittswerte ± sd dar (n = 3 unabhängige Experimente pro Gruppe). Die Expansion verdeutlicht die Bildung von P[5]a-LPS-Komplexen unter 0,5-fachen und 1-fachen physiologischen Bedingungen. b Die in (a) beobachtete Wechselwirkung und Aggregation ist durch Zugabe von Salz (NaCl) reversibel, was zur Dissoziation der größeren Komplexe führt. Die Daten stellen Durchschnittswerte ± sd dar (n = 3 unabhängige Experimente pro Gruppe). c Schematische Darstellung der NaCl-Effekte auf die Komplexierung von P[5]a-LPS. d Die analytische Ultrazentrifugation zeigt den Sedimentationskoeffizienten von P[5]a allein auf der linken Seite bei 60.000 U/min und P[5]a mit LPS von PA10 auf der rechten Seite bei 25.000 U/min, was das Vorhandensein von Strukturen mit hohem Molekulargewicht bis zu 1 verrät ×106 Da. Die Erweiterung zeigt, dass ein Großteil des LPS, 91 %, in den größeren P[5]a-LPS-Komplexen vorhanden ist (n = 1 unabhängiges Experiment pro Gruppe). e P[5]a verstärkt die Wirksamkeit der gleichzeitig verabreichten Antibiotika Amikacin, Cefepim, Ceftazidim und Meropenem in sechs klinischen MDR-resistenten P. aeruginosa-Isolaten. MHK-Werte gemäß dem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI): 37 empfindlich (unterhalb der gelben Linie), mittel empfindlich (zwischen gelber und roter Linie) und resistent (oberhalb der roten Linie). f–i Serielle Passage von PAO1 mit den Antibiotika Aztreonam (f), Cefepim (g), Meropenem (h) und Tobramycin (i) sowie gleichzeitige Verabreichung der Antibiotika mit P[5]a. Die gleichzeitige Verabreichung verlangsamte die Entwicklung einer Resistenz von PAO1 gegenüber der jeweiligen Antibiotikabehandlung erheblich. Cefepim erreichte nach vier Tagen 128 µg/ml, was der höchsten Konzentration des enthaltenen Antibiotikums entsprach. j Die durchschnittliche Zeit (d), die PAO1 benötigt, um den MHK-Wert zu verdoppeln, der zur Abtötung des Erregers erforderlich ist, wie in (f–i) sowohl bei einer Einzel- als auch bei einer Kombinationsbehandlung zu sehen ist, zeigt, dass die gleichzeitige Verabreichung die Zeit zur Resistenzverdoppelung verkürzt. k Schematische Darstellung des im OM positionierten LPS (links). P[5]a interagiert mit LPS im OM und beeinflusst wahrscheinlich die straffe Organisation des OM, was die Wirksamkeit von Antibiotika mit intrazellulären Zielen bei einer kombinierten Verabreichung verbessert.

Um zu untersuchen, ob die beobachtete Komplexierung mit LPS dessen Funktion in der Außenmembran beeinflusst, untersuchten wir klinische Isolate mit verringerter Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika (Supplementary Data 1). Wir verabreichten P[5]a zusammen mit vier Standardantibiotika mit intrazellulären Zielen, nämlich Amikacin, Cefepim, Ceftazidim und Meropenem (Abb. 4e). In allen Kombinationen mit P[5]a waren die Werte der minimalen Hemmkonzentration (MHK) für die klinischen Isolate im Vergleich zur alleinigen Antibiotikabehandlung verringert. Die stärkeren Reduktionen waren nicht spezifisch für einen klinischen Isolatstamm oder einen Antibiotikatyp, was darauf hindeutet, dass die Membraninterferenz die Penetration aller Antibiotika mit intrazellulären Zielen fördert. Diese Beobachtung steht im Einklang mit anderen OM-Sensibilisatoren34,38.

Anschließend untersuchten wir den Aufbau einer Resistenz bei PAO1 gegenüber einer Antibiotikatherapie über einen Zeitraum von 14 Tagen. Während bei alleinigen Antibiotikatherapien mit Aztreonam, Cefepim, Meropenem und Tobramycin (Abb. 4f-i) bei allen Verabreichungen Resistenzen auftraten, trat bei der kombinierten Verabreichung kein Antibiotikum auf Resistenzen auf. Aztreonam, Cefepim und Tobramycin blieben vollständig empfindlich, während Meropenem eine mittlere Empfindlichkeit erreichte. Die durchschnittliche Zeit bis zur Verdoppelung des Widerstandsniveaus war stark verlängert (Abb. 4j). Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse das Potenzial von P[5]a, verfügbare Antibiotikatherapien wiederzubeleben und Resistenzen zu reduzieren (Abb. 4k).

Isolate aus akuten Infektionen produzieren häufig erhöhte Mengen an Endotoxinen, Proteasen und Siderophoren und zeigen eine erhöhte Motilität39. Im Gegensatz dazu legen Isolate aus chronischen Infektionen häufig Wert auf einen schleimigen Phänotyp, kürzere Verdoppelungszeiten und eine erhöhte Biofilmproduktion. Zu dieser Variation kommt eine Vielzahl immer häufiger auftretender Resistenzmechanismen hinzu. Zusammengenommen haben diese Merkmale die Hemmschwelle für neuartige Behandlungen erheblich erhöht40. Folglich testeten wir die Wirksamkeit von P[5]a gegen eine große Untergruppe von 72 P. aeruginosa-Isolaten, bestehend aus einer Serotypensammlung des International Antigenic Scheme (IATS) (19 Isolate), einer chronischen CF-Sammlung (20 Isolate) und einer Reihe von multiresistente (MDR) klinische Isolate mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzprofilen (33 Isolate) (Abb. 5a, Ergänzende Daten 1). P[5]a zeigte eine weitreichende Aktivität und reduzierte die Biofilmmenge um über 96 %, mit einer Signifikanz von über 92 %. Allerdings war bei einem Isolat die Biofilmproduktion deutlich hochreguliert. Wir konnten keine Unterschiede in der Wirkung von P[5]a auf verschiedene P. aeruginosa-Sammlungen, den bakteriellen Phänotyp, das Antibiotikaresistenzprofil oder den Isolationsort beobachten. Bemerkenswert ist, dass sich P[5]a auch gegen ΔLasR-Mutanten (+) als wirksam erwies, die die Fähigkeit verloren haben, den 3-Oxo-C12-HSL zu erkennen, der besonders häufig in P. aeruginosa-Stämmen vorkommt, die aus chronischen CF-Infektionen isoliert wurden41. Die Einordnung der dokumentierten resistenten Antibiotikaprofile (ergänzende Tabelle 1) in Bezug auf die Funktion von P[5]a (Abb. 5b) zeigt, dass P[5]a gegen die meisten Antibiotikaresistenzmechanismen wirksam bleibt und diese umgeht.

a Wirkung von P[5]a auf die Biofilmhemmung nach einer 24-stündigen statischen Kulturbildung in einer Gruppe von P. aeruginosa-Isolaten, bestehend aus P. aeruginosa IATS-Serotypen, einer Reihe von Isolaten von Mukoviszidose-Patienten, die an chronischen Infektionen leiden, und a Satz klinischer MDR-Isolate, die von verschiedenen Infektionsherden stammen. (+) Isolate mit schillerndem und metallischem Glanz der Kolonieoberfläche, der typisch für eine ΔlasR-Mutante ist. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe). b Wirkung von P[5]a auf die Biofilmhemmung in deutlich resistenten klinischen Isolaten des in (a) gezeigten Panels. P[5]a hemmte erfolgreich Biofilme in resistenten Isolaten, unabhängig von der Art oder dem Wirkmechanismus des Antibiotikums. Die Farben der Antibiotika entsprechen der Antibiotikaklasse. Es wurden nur Isolate einbezogen, die als resistent gegenüber einer Antibiotikabehandlung gekennzeichnet waren. Die Anzahl der resistenten Isolate pro Antibiotikatyp reicht von Piperacillin-Tazobactam bis Ciprofloxacin 7, 12, 35, 15, 13, 9, 35, 8, 9, 12, 12 bzw. 11. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), die oberen und unteren Quantile (Box) und den Bereich der Daten (Whisker). c) Wirkung von P[5]a auf die Unterdrückung des Pyocyanintoxins über einen Zeitraum von 14 Tagen. P[5]a unterdrückte erfolgreich die Toxinspiegel über die 14 Tage hinweg, ohne dass eine Abnahme der Wirksamkeit zu beobachten war. Die Erweiterung verdeutlicht die Auswirkungen von P[5]a auf die Toxinunterdrückung rekultivierter MIC50-Isolate aus den Cefepim- (links) und Meropenem-resistenten Einzelentwicklungsexperimenten (rechts) (Abb. 4g bzw. h). Da sich gegenüber diesen Antibiotika schnell eine Toleranz und anschließend eine Resistenz entwickelt, bleibt P[5]a wirksam bei der Unterdrückung von Toxinen. d P[5]a zerstört Biofilme, die von hochresistenten klinischen Isolaten von P. aeruginosa in vitro gebildet werden; mittlere Biofilmmasse, die nach 16-stündiger Behandlung mit P[5]a verbleibt. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 4 pro Gruppe). Zweiseitiger gepaarter t-Test **P < 0,01 *P < 0,05. e Fluoreszenzmikroskopische Bilder von gebildeten Biofilmen durch P. aeruginosa-Isolate zeigen die Beseitigung gebildeter Biofilme durch P[5]a nach 16-stündiger Behandlung. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Maßstabsbalken, 200 µm.

Angesichts der weit verbreiteten Aktivität gegen klinische Isolate und der verringerten Resistenzentwicklung gegen Antibiotika bei kombinierter Verabreichung testeten wir als nächstes die Resistenzentwicklung in vitro (Abb. 5c). PAO1 wurde wiederholt in Gegenwart von P[5]a passagiert, wobei die Pyocyaninspiegel während der 14-tägigen Studie unterdrückt blieben. Als nächstes behandelten wir alle MIC50-Kulturen von PAO1, die wiederholt passagiert wurden, erneut mit den Antibiotika Cefepim und Meropenem (Abb. 4g bzw. h). Selbst als PAO1 eine schnelle Toleranz und Resistenz gegenüber den Antibiotika entwickelte, blieb P[5]a voll wirksam (Cefepim, vergrößert links und Meropenem, vergrößert rechts in Abb. 5c). Jüngste Bemühungen haben ergeben, dass eine Antibiotikatoleranz der Entwicklung einer Antibiotikaresistenz vorausgeht42,43. Weder Toleranz- noch Resistenzmechanismen gegenüber Antibiotika beeinflussten die Funktion von P[5]a in vitro, was das Potenzial nicht-bakterizider und/oder bakteriostatischer Virulenz-Targeting-Strategien mit reduziertem Selektionsdruck unterstützt6,7,25.

Wie das OM ist der Biofilm im Allgemeinen negativ geladen und besteht hauptsächlich aus LPS und extrazellulären Polymersubstanzen44,45. Wir untersuchten, ob P[5]a auch bestehende Biofilme zerstören kann, indem wir vier hochresistente P. aeruginosa-Biofilme nach einer 24-stündigen Bildungsperiode 16 Stunden lang P[5]a aussetzten (Abb. 5d, e). Mit Ausnahme des P. aeruginosa-Isolats 5550 wurde in allen Fällen eine signifikante Beseitigung des Biofilms beobachtet. Im P. aeruginosa-Isolat 5842 wurde die Biofilmmasse um mehr als 75 % reduziert.

Biologische Membranen weisen bemerkenswerte Ähnlichkeiten auf: Glycerophospholipide sind in beiden eukaryotischen Doppelschichtmembranen sowie in der inneren Packungsbeilage des bakteriellen OM vorhanden, und LPS ist in der äußeren OM-Beutelhülle vorhanden. Wir beobachteten Wechselwirkungen zwischen P[5]a und dem OM, die zu einer Permeabilisierung des OM führten. Als nächstes wandten wir uns A549-Epithelzellen mit einer Doppelschichtmembran zu, die aus Glycerophospholipiden besteht, wichtigen Effektorzellen, die physische Barrieren gegen Krankheitserreger darstellen. Wir haben die Auswirkungen von P[5]a auf die Lebensfähigkeit von A549-Epithelzellen mithilfe der Trypanblau-Färbung bestimmt und dabei eine geringe Toxizität gegenüber A549-Zellen und keine beobachtbare membranlytische Aktivität gezeigt (Abb. 6a). Dies deutet weiter darauf hin, dass die Wechselwirkungen mit dem bakteriellen OM durch Wechselwirkungen in der äußeren Membranmembran erfolgen, in die LPS eingefügt wird, und nicht durch Auswirkungen auf die aus Glycerophospholipiden bestehende innere Membran.

eine Trypanblau-Lebensfähigkeitsbewertung von A549-Epithel-Lungenzellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von P[5]a behandelt wurden. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate dar. Mittelwert (± SEM) (n = 3 pro Gruppe). b A549-Epithelzellen, die 16 Stunden lang mit PAO1 in Kontakt gebracht wurden, zeigen Apoptose. P[5]a stellt die durch PAO1 induzierte Apoptose konzentrationsabhängig wieder her. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 3 pro Gruppe). c Fluoreszenzmikroskopische Bilder von A549-Epithelzellen, wie in (b) zu sehen, entweder unbehandelt, P[5]a-behandelt oder 16 Stunden lang mit PAO1 belastet. Bei Behandlung mit P[5]a wird eine konzentrationsabhängige Wiederherstellung des Zelltods beobachtet. Maßstabsbalken, 50 µm. d Normalisierte Expressionswerte aus der mRNA-Sequenzierung zeigen, dass die Zugabe von 0,1 mM und 2,5 mM gut vertragen wird und keine signifikanten Änderungen in der Genregulation auftreten. A549-Zellen, die dem bakteriellen Pathogen PAO1 ausgesetzt sind, zeigen eine starke Aktivierung zellulärer Stress-, Entzündungs- und Zelltodreaktionen. Die Zugabe einer P[5]a-Behandlung zu den belasteten A549-Zellen führt zu einer konzentrationsabhängigen Verringerung der zellulären Stress-, Entzündungs- und Zelltodreaktionen und erhöht auch die Abwehrreaktionen gegen Bakterien (n = 3); Zweiseitiger Wald-Test p-Wert: 0,01. Das VENN-Diagramm des Genregulationsnetzwerks überschneidet sich mit Auswirkungen von Infektion und Behandlung. f Log2FC-Expressionsänderungen im Zusammenhang mit unterschiedlich exprimierten GO Biological Process-Gensätzen; I, II, II entspricht den Diagrammen in (e); Zweiseitiger BH-bereinigter p-Wert.

Als nächstes prüften wir, ob P[5]a Epithelzellen vor dem gesamten Virulenzarsenal eines klinisch relevanten Krankheitserregers schützen kann. P[5]a schützte A549-Zellen dosisabhängig vor Apoptose durch PAO1, mit vollem Schutz bei Konzentrationen über 1 mM (Abb. 6b, c). Die Dosisabhängigkeit von P[5]a, die erforderlich ist, um einen vollständigen Schutz in A549 gegen PAO1 zu erreichen, war vergleichbar mit den Mengen, die zur Hemmung der Virulenzfaktoren (Pyocyanin, 3-Oxo-C12, LPS, Biofilm) erforderlich sind, was darauf hindeutet, dass diese Virulenzfaktoren vorhanden sind die wichtigsten zytotoxischen Wirkstoffe, die der Erreger während der Infektion nutzt.

Um die Schutzwirkung von P[5]a während einer bakteriellen Infektion besser zu verstehen, analysierten wir die Gesamt-mRNA aus den A549-Epithelzellen (Abb. 6d). P[5]a allein hatte nur minimale Auswirkungen auf A549-Epithelzellen, wobei keines der unterschiedlich exprimierten Gene um mehr als log2FC ± 1,2 verändert wurde. Darüber hinaus haben wir keine Reaktionen beobachtet, die auf Veränderungen in der Stabilität der Doppelschichtmembran hinweisen. Die Zugabe von PAO1 zu A549-Zellen veränderte die Expressionsniveaus erheblich, wobei die Anreicherung des Gensatzes (GO Biological Processes) erhebliche Veränderungen in der Entzündungsreaktion, der Reaktion auf Moleküle bakteriellen Ursprungs, der Chemotaxis, dem Zelltod und der Regulierung der Zellproliferation zeigte (Abb. 6e, f ). Der größte Anstieg wurde bei den Chemokinliganden (CCL20, CXCL1, CXCL2 und CXCL3) zusammen mit dem Oberflächenrezeptor (ICAM1) beobachtet, die alle eine Schlüsselrolle bei Immun- und Entzündungsreaktionen spielen28. Die Zugabe von P[5]a zu infizierten A549-Epithelzellen führt zu einer konzentrationsabhängigen Verringerung der Entzündungsreaktion, der Chemotaxis, des Zelltods, der Reaktion auf Moleküle bakteriellen Ursprungs und der Regulierung von Gensätzen für die Zellproliferation. Die signifikanteste dosisabhängige Verringerung der Expression wurde bei den Chemokinen CCL20, CXCL1, CXCL8 und ICAM1 beobachtet. Wir beobachteten eine erhöhte Expression von Adrenomedullin (ADM) und Kolonie-stimulierendem Faktor 2 (CSF2), die beide an der Abwehrreaktion auf bakterielle Infektionen beteiligt sind46,47, was darauf hindeutet, dass reduzierter Stress und Entzündungsreaktionen die Fähigkeit zur Bakterienbeseitigung erhöhen.

Wir erkannten die wichtige Rolle, die Virulenzfaktoren bei der Etablierung und Ausbreitung bakterieller Infektionen in ihren eukaryontischen Wirten spielen, und untersuchten weiter die direkten Wechselwirkungen zwischen P[5]a und gereinigtem 3-Oxo-C12 und LPS sowie die daraus resultierenden Auswirkungen auf das A549-Epithel Zellengesundheit. In Bakterien diffundiert das 3-Oxo-C12-HSL frei durch Bakterienmembranen, wo es als Signalmolekül genutzt wird. In Säugetierzellen interagiert das 3-Oxo-C12-HSL jedoch mit Doppelschichtmembranen und führt zur Zerstörung von Lipiddomänen. Dies führt zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen, TNFR1, das den Zelltod von Lymphozyten signalisiert, und einer Verschlimmerung der Atemwegsentzündung48. In ähnlicher Weise ist LPS ein bekanntes pathogenassoziiertes molekulares Muster, dessen Lipid-A-Region vom Toll-like-Rezeptor TLR4 erkannt wird, was zur Freisetzung entzündlicher Zytokine, Zelltodreaktionen, erhöhter Durchlässigkeit der Atemwegsbarriere und Lungenentzündung führt. A549-Zellen, die mit gereinigtem 3-Oxo-C12 oder LPS behandelt wurden, zeigten zum ersten Zeitpunkt nach 2 Stunden einen beobachtbaren erhöhten Zelltod, der im Laufe der Zeit stetig zunahm. Die Zugabe von P[5]a verhinderte den Tod von Epithelzellen, sowohl mit 3-Oxo-C12 als auch mit LPS, und schützte die A549-Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden (Abb. 7a, b). Diese Ergebnisse zeigen, dass i) die Wechselwirkung die Fähigkeit von 3-Oxo-C12 und LPS, Lipiddoppelschichtdomänen zu zerstören, schnell beeinträchtigt, ii) die Wechselwirkung über die Zeit stabil ist (über einen Zeitraum von 24 Stunden) und iii) die gebildeten Komplexe nicht dissoziieren.

a Die Zugabe von P[5]a bindet das 3-Oxo-C12-HSL und schützt so A549-Epithelzellen über einen Zeitraum von 24 Stunden vor Apoptose. Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 4 pro Gruppe). Zweiseitiger gepaarter t-Test ***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. b Die Zugabe von P[5]a schützt A549-Epithelzellen über einen Zeitraum von 24 Stunden vor LPS-induzierter Apoptose (Pa-Serotyp 10, 20 µg/ml). Die Daten stellen Durchschnittswerte biologischer Replikate ± Standardabweichung dar (n = 4 pro Gruppe). Zweiseitiger gepaarter t-Test ***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. c) Studiendesign zur LPS-Endotoxin-Sequestrierung. P[5]a wird eine Stunde vor der Zugabe des Provokationswirkstoffs LPS (Pa-Serotyp 10, 10 µg/kg) intratracheal verabreicht. Nach 4 und 24 Stunden wird die BALF-Flüssigkeit gesammelt und die Menge der Leukozyten und Neutrophilen im BALF sowie der entzündlichen Zytokine quantifiziert. d) Auswirkungen von P[5]a, dosiert, auf die LPS-stimulierten Gesamt-WBC-Zahlen in BALF. e Auswirkungen von P[5]a, dosiert, auf die LPS-stimulierte Gesamtzahl der Neutrophilen in BALF. fi Auswirkungen von P[5]a, dosiert, auf LPS-stimulierte (f) TNF-α, (g) IL-&, (h) CXCL1 (KC) und (i) CXCL2 (MIP-2) zählt in BALF . Ein Tier (3 mg/kg, 4 h) starb unmittelbar nach der Behandlung. Die statistische Analyse wurde mittels One Way ANOVA durchgeführt, gefolgt vom Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche und dem Grubb-Test, um Ausreißer auszuschließen. Alle Gruppen vs. mit Fahrzeug/LPS behandelte Gruppe, *p < 0,05, **p < 0,01, Mittelwert (± SEM) (n = 10 Tiere pro Gruppe).

Als nächstes untersuchten wir, ob P[5]a bei weiblichen C57BL/6 J-Mäusen, die mit LPS herausgefordert wurden, vor Lungenentzündungen schützt. Die intranasale Verabreichung von LPS, das vom TRL4-Rezeptor erkannt wird, führt zur Auslösung einer starken Entzündungsreaktion, die durch die Infiltration von Neutrophilen und weißen Blutkörperchen in die extrazelluläre Matrix und durch die Freisetzung von Zytokinen gekennzeichnet ist, die in der Lunge eine grundlegende Rolle spielen Gewebeschäden (Abb. 7c). Drei ansteigende Konzentrationen von P[5]a (0,1, 0,5 und 3 mg/kg) wurden intratracheal verabreicht (it). Nach 24 Stunden führten 3 mg/kg P[5]a zu einer 30-prozentigen Gesamtreduktion der LPS-stimulierten weißen Blutkörperchen (WBC) und Neutrophilen in der Bronchoalveolarflüssigkeit (BALF), wenn auch nicht statistisch signifikant (Abb. 7d, e, jeweils). Nach 4 Stunden und bei Dosierungen von 0,1 und 0,5 mg/kg P[5]a wurden keine beobachtbaren Unterschiede beobachtet. Als nächstes untersuchten wir die Freisetzung entzündlicher Zytokine als Reaktion auf die LPS-Stimulation. Nach 4 Stunden wurden, abgesehen von IL-6, keine signifikanten Unterschiede in den Zytokinspiegeln zwischen LPS-stimulierten und P[5]a-behandelten Gruppen beobachtet (ergänzende Abbildung 11). Allerdings wurde nach 24 Stunden nach der Behandlung mit P[5]a eine signifikante Verringerung der Zytokinspiegel beobachtet. Wichtig ist, dass die TNF-ɑ-Spiegel, ein charakteristisches proinflammatorisches Zytokin, das für die Regulierung der Immunzellen und die Zellapoptose verantwortlich ist, selbst bei der niedrigsten Dosis von 0,1 mg/kg signifikant reduziert wurden (Abb. 7f, ergänzende Abb. 12, 13). Auch das Zytokin IL-6 und die Chemokine CXCL1 und CXCL2, wichtige Chemoattraktoren für Makrophagen und Neutrophile, zeigten bei der niedrigsten Dosis von 0,1 mg/kg statistisch signifikante Reduktionen (Abb. 7g, h, i). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass P[5]a nicht nur Epithelzellschäden, Zelltod und verstärkte Abwehrreaktionen verhinderte, sondern auch deren durch Virulenz induzierte Entzündungsaktivierung reduzierte. Letzteres ist in vivo von großer Bedeutung, da unkontrollierte Entzündungsreaktionen zu pulmonalen Exazerbationen und ausgedehnten Gewebeschäden führen49.

Die Antibiotikatherapie ist die tragende Säule der Behandlung bakterieller Infektionen. Ihr großflächiger Einsatz in Kombination mit einem begrenzten Spektrum an bakteriellen Zielen hat jedoch zu Resistenzen geführt und sowohl bestehende Therapien als auch die Entwicklungspipeline unter Druck gesetzt.

Hier verwenden wir ein Anti-Virulenz-Screening von Wirt-Gast-interagierenden Makrozyklen und identifizieren ein wasserlösliches synthetisches Pillararen, P[5]a (Ergänzende Abbildung 14–17), das nicht bakterizid/bakteriostatisch ist. Es stellt einen Wirkmechanismus dar, der die Bindung an HSLs (innerer Hohlraum) und LPS (kationischer Rand) beinhaltet, wichtige Virulenzfaktoren bei gramnegativen Krankheitserregern.

Wir haben gezeigt, dass P[5]a HSLs mit unterschiedlichen Kettenlängen effektiv mit Bindungskonstanten im mikromolaren Bereich bindet. Wir beobachteten eine verbesserte Bindung mit zunehmender Länge der HSL-Gast-Alkylkette, was darauf hindeutet, dass hydrophobe Wechselwirkungen zum Erkennungsprozess beitragen. Diese Ansicht wird sowohl quantitativ als auch qualitativ durch NMR, Farbstoffverdrängung und Modellierung hydrophober/hydrophiler Karten gestützt und zeigt, dass die längeren hydrophoben Alkylketten tief in der aromatischen Kavität von P[5]a platziert sind. Die Zugabe von NaCl hatte keinen großen Einfluss auf die Bindungskonstanten der HSLs (unabhängig von der Länge der Alkylketten), was darauf hindeutet, dass elektrostatische Wechselwirkungen nicht zum Erkennungsprozess und zur Bindungsstabilität beitragen. Die Bindung der HSLs führte zur Hemmung von QS-assoziierten Virulenzreaktionen, einschließlich Toxinen, Motilität und Biofilmen. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass P[5]a als wirksame Antivirulenzstrategie fungieren könnte, insbesondere bei Krankheitserregern, die HSLs mit langen hydrophoben Acylketten nutzen.

Andererseits beobachteten wir, dass elektrostatische Wechselwirkungen eine Schlüsselrolle bei der Bindung von P[5]a an LPS auf dem OM spielen, einer äußerst undurchlässigen Barriere für ansonsten wirksame Antibiotikabehandlungen. LPS auf dem OM wird durch zweiwertige Kationen angeordnet und stabilisiert, die elektrostatische Brücken zwischen der Lipid-A-Domäne4, hauptsächlich Ca2+ und Mg2+, bilden. Wir nehmen an, dass die Bindung von P[5]a durch die positiv geladenen Reste am funktionalisierten Rand von P[5]a vermittelt wird, die mit der anionischen Lipid-A-Einheit interagieren. Wir beobachteten, dass die Wechselwirkung mit LPS zu einer Störung der OM-Organisation führt und den Zugang und die Wirksamkeit von Standardantibiotika zu ihren intrazellulären Zielen erleichtert, unabhängig von ihrem MoA (Abb. 4e). Wir zeigen auch, dass diese Synergie genutzt werden könnte, um die Resistenzentwicklung in vitro zu reduzieren und möglicherweise die Antibiotikatherapie wiederzubeleben (Abb. 4e–i). Unterstützt durch frühere Berichte über kationische Makrozyklen12,21 und die Annahme, dass LPS ein Hauptbestandteil bakterieller Biofilme ist45, untersuchten wir die Beseitigung gebildeter Biofilme durch P[5]a. Angesichts der Komplexität der Zusammensetzung bakterieller Biofilme sind jedoch zukünftige Anstrengungen erforderlich, um die Wechselwirkungen, die die Ausrottung steuern, eingehend zu verstehen.

LPS ist auch das Ziel des Antibiotikums Polymyxin B (PMB). Polymyxine verdrängen kompetitiv Kationen aus den Lipid-A-Domänen, was zu einer Destabilisierung des OM führt. Wo PMB jedoch auch die Depolarisation oder Destabilisierung der Zytoplasmamembran induziert, zeigten Untersuchungen der Lebensfähigkeit der Bakterien (Abb. 1f), dass P[5]a keine erkennbaren Auswirkungen auf die Zytoplasmamembran hatte. Wir spekulieren, dass die Wirkung von P[5]a auf die Bakterienmembran eher mit der von SPR74134 und den OM-zielenden Antibiotika (OMPTAs) vergleichbar sein könnte50,51,52. Diese Moleküle behalten die Fähigkeit, die äußere Packungsbeilage des bakteriellen OM zu zerstören, wo LPS eingefügt wurde, ihnen fehlt jedoch die Fähigkeit, mit der inneren Packungsbeilage des bakteriellen OM, die aus Glycerophospholipiden und den Zytoplasmamembranen besteht, zu interagieren. Dies wird weiter durch das Fehlen lytischer Wirkungen von P[5]a auf eukaryontische Lipiddoppelschichtmembranen gestützt, die ebenfalls aus Glycerophospholipiden bestehen (Abb. 5a – e, ergänzende Abb. 11).

Die Validierung anhand klinischer MDR-Isolate zeigt, dass P[5]a weiterhin gegen Krankheitserreger mit einer Vielzahl von Antibiotikaresistenzmechanismen aktiv bleibt, darunter Carbapenem-resistente A. baumannii und P. aeruginosa mit höchster Priorität. Darüber hinaus hat P[5]a keine bakterizide/bakteriostatische Wirkung, was die Entwicklung einer schnellen Resistenz unwahrscheinlich macht53. Dies wird durch die wirksame Unterdrückung von Giftstoffen über einen Zeitraum von 14 Tagen unterstützt. Darüber hinaus blieben diese Isolate zu jedem Zeitpunkt vollständig anfällig für P[5]a, da sich im Laufe einer 14-tägigen Behandlung eine Toleranz und später eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Cefepim und Meropenem entwickelte. Insgesamt verdeutlichen diese Ergebnisse die potenziellen Auswirkungen, die unterschiedliche bakterielle Ziele und Strategien gegenüber Standardantibiotika haben können, indem Antibiotikaresistenzmechanismen umgangen und bakterielle Resistenzaufbaumechanismen vermieden werden; Dadurch könnten möglicherweise einige der größten Engpässe umgangen werden, mit denen derzeit die Entwicklung von Antiinfektiva konfrontiert ist. Eine zentrale Frage bleibt, ob klinische Isolate mit Resistenz gegen Colistin und PMB, deren primäre Resistenzmechanismen 4-Aminoarabinose- und Phosphoethanolamin-Modifikationen des Lipid A sind, die Aktivität von P[5]a54 beeinflussen. Interessanterweise blieb P[5]a jedoch gegen ΔLasR-Isolate aktiv, denen der 3-Oxo-C12-HSL-Rezeptor fehlt (Abb. 5a). Dies deutet darauf hin, dass die Polypharmakologie der Verbindung eine wirksame Strategie zur Überwindung partieller Resistenzen sein könnte. Daher wurde in dieser Arbeit der duale Wirkungsmechanismus von P[5]a, über den zuvor18 berichtet wurde, ausgenutzt, um sowohl auf den 3-Oxo-C12-HSL (innerer Hohlraum, hydrophobe Wechselwirkung) als auch auf LPS (äußerer polykationischer Rand, elektrostatische Wechselwirkungen) abzuzielen. und stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung bakterieller Resistenzen dar.

Wir beobachteten, dass die Bindung von P[5]a sowohl an 3-Oxo-C12 als auch an LPS zu einer direkt wirkenden Sequestrierung ihrer toxischen Eigenschaften führt, sowohl in vitro als auch in vivo. Toxine zerstören gemeinsam die Gewebebarrieren, behindern die Immunabwehr des Wirts gegen Krankheitserreger, fördern das Bakterienwachstum und die Kolonisierung und erhöhen die Chancen einer erfolgreichen Infektion7. 3-Oxo-C12- und LPS-belastete A549-Zellen wurden durch Zugabe von P[5]a vollständig geschützt (Abb. 5a, b). Die Bindung von LPS unterstützt außerdem die spezifische Interaktion von P[5]a mit der Lipid-A-Einheit, da speziell die Lipid-A-Region vom TLR4-Rezeptor erkannt wird, was zur Zytokinfreisetzung und Zelltodreaktionen führt. Darüber hinaus zeigte die Zugabe von P[5]a zu mit PAO1 infizierten A549-Zellen eine dosisabhängige Wiederherstellung des Zelltods, was darauf hindeutet, dass Toxine und andere Virulenzfaktoren eine zentrale Rolle bei Zelltodreaktionen und der Ausbreitung von Infektionen spielen im Einklang mit früheren Beobachtungen (Abb. 5c – g)6,7.

Unsere Daten liefern ein überzeugendes Argument dafür, Makrozyklus-basierte Virulenzinhibitoren als Paradigma für die Behandlung bakterieller Infektionen zu verfolgen. Ihre doppelte Funktion, die Virulenz durch HSL-Sequestrierung in ihrer inneren Höhle zu hemmen, zusammen mit OM-potenzierenden Wirkungen, die Krankheitserreger gegenüber Antibiotika sensibilisieren, unterstützt die Verwendung von P[5]a sowohl als eigenständige als auch als Kombinationsbehandlung mit bestehenden Antiinfektiva. Unsere Ergebnisse bieten auch einen vielversprechenden Ausblick auf den Einsatz rationaler Wirt-Gast-Chemie zur Synthese doppelt wirkender Moleküle, die bei der Behandlung antibiotikaresistenter bakterieller Krankheitserreger eingesetzt werden können.

Unsere Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften; Italienisches Gesetzesdekret Nr. 26/2014 und europäische Richtlinie Nr. 2010/63/UE. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der nationalen Gesetzgebung, mit Genehmigung des internen Aptuit-Ausschusses für Tierforschung und Ethik und mit Genehmigung des italienischen Gesundheitsministeriums (Autorisierungsprojekt des italienischen Gesundheitsministeriums – Interner Code Nr. 30004-B64) durchgeführt.

Eine vollständige Tabelle der in dieser Studie verwendeten Zelllinien, Bakterienstämme und Plasmide ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Der E. coli-Stamm Top10 wurde für die Klonierung und Plasmidkonstruktion verwendet, während der Stamm CY008 (BW25113 ΔlacI ΔaraC ΔsdiA; Bennett-Labor, Rice University , Texas, USA) wurde für alle Fluoreszenzmessungen verwendet.

Einzelne Kulturen wurden über Nacht in Luria-Bouillon (LB) mit geeigneten Antibiotika (Ampicillin, 100 μg mL-1 und Kanamycin, 50 μg mL-1) bei 37 °C gezüchtet.

Die klinischen Isolate von P. aeruginosa und A. baumannii wurden aus mehreren Quellen bezogen: Das Panel der klinischen CF-Isolate wurde von Dr. A. Bragonzi, Gruppenleiter der Abteilung für Infektionen und zystische Fibrose am San Raffaele Institute, bezogen.

Klinische Isolate von P. aeruginosa und A. baumannii wurden aus der Sammlung des Universitätskrankenhauses Helsinki (HUS) bezogen oder von Chefarzt Dr. A. Pätäri-Sampo aus Patienten isoliert. Die Sammlung der Isolate entsprach vollständig dem Gesetz über den Status und die Rechte der Patienten“ (785/1992). Daher waren die aus HUS-Isolaten gesammelten klinischen Informationen begrenzt und in keiner Weise auf einzelne Patienten zurückzuführen. Die dokumentierten Informationen beschränkten sich auf den Bakterienserotyp, den Ort der Isolierung und das Antibiotikaresistenzprofil.

„Superbugs mit globaler Priorität“ wurden aus der ATCC-Sammlung klinisch relevanter, arzneimittelresistenter Stämme mit Quellenmetadaten sowie genotypischer und phänotypischer Charakterisierung gewonnen.

A549-Zellen des menschlichen Lungenkarzinoms wurden vor Beginn des Experiments mit TrypLE (Thermo Fisher Scientific) behandelt, aufgeteilt, gezählt und in 96-Well-Platten mit 20.000 Säugetierzellen pro Well aliquotiert. Die Zellzahlen wurden mit einem TC20-Zellzähler (BioRad) geschätzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in DMEM (Gibco) mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco), 1× PenStep (Sigma) und 1× GlutaMAX (Gibco) gezüchtet. Nach der 24-stündigen Wachstumsphase wurden die Zellen mit warmem 1x PBS gewaschen.

Plasmide wurden wie zuvor beschrieben konstruiert55. Kurz gesagt wurden Fragmente in zwei verschiedene Vektorgerüste kloniert, pACYC (amp) für die Rezeptorproteine ​​und pColE1 (kan) für die AHL-Promotoren, die mit den fluoreszierenden Proteinen fusioniert wurden. Alle Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Die fluoreszierenden Proteine ​​ECFP, EGFP, mKO2 und mCherry wurden mit der LAA-Abbau-Tag-Sequenz markiert. Plasmide sind in der Zusatzinformationstabelle 2 beschrieben.

Homoserinlactone (HSLs; N-Butyryl-L-HSL (C4), N-(ß-Ketocaproyl)-DL-HSL ( > 98 %) (3-Oxo-C6), N-(p-Coumaroyl)-L- HSL ( > 94 %) (pC), N-(3-Oxoocatnoyl)-L-HSL ( > 97 %) (3-Oxo-C8) und N-(3-Oxododecanoyl)-L-HSL ( > 98 %) (3-Oxo-C12) wurden wie von Sigma-Aldrich erhalten verwendet. N-(3-Hydroxy-7-cis-tetradecanoyl)-L-HSL (> 95 %) (3-OH-C14:1) wurde verwendet erhalten von Cayman Chemical. Organische Lösungsmittel wurden von Sigma-Aldrich und VWR bezogen. Methylorange wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Lipopolysaccharide, gereinigt durch Phenolextraktion aus Pseudomonas aeruginosa 10, wurden von Sigma-Aldrich bezogen. 12-Krone-4, 2 -Hydroxymethyl-12-Krone-4, 1-Aza-15-Krone-5, 15-Krone-5, 4-Sulfocalix[4]aren, 18-Krone-6, Cucurbit[6]urilhydrat, (2-Hydroxypropyl). )-ɑ-Cyclodextrin, ɑ-Cyclodextrin, Calix[6]aren, 4-tert-butylcalix[6]aren, Methyl-β-cyclodextrin, (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, β-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ƴ-Cyclodextrin, ƴ-Cyclodextrin und Calix[8]aren wurden von Sigma Aldrich & Merck bezogen. Die P[5]s wurden gemäß den beschriebenen Verfahren mit vollständiger Charakterisierung synthetisiert56,57. Kurz gesagt wurde 1,4-Bis(2-hydroxyethoxy)benzol in Gegenwart von Kohlenstofftetrabromid und Triphenylphosphin in Acetonitril in 1,4-Bis(2-bromethoxy)benzol umgewandelt. Im nächsten Schritt wurde das Decabrompillar[5]aren durch die Reaktion von 1,4-Bis(2-bromethoxy)benzol und Paraformaldehyd in Gegenwart von Bortrifluoriddiethyletherat in Dichlormethan unter Argonatmosphäre erhalten. Im letzten Schritt wird das Decabrompillar[5]aren mit Trimethylamin in Ethanol unter Rückfluss erhitzt, wobei das endgültige P[5]a nach dem Waschen mit mehr Ethanol als Niederschlag gesammelt wird. Das Calix[4]resorcinaren wurde zuvor von uns synthetisiert und darin vollständig charakterisiert58.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 200 µL vorbereitet und in einer 96-Well-Platte (Corning) bei 20 °C gemessen. Von jeder Probe wurde der Leerwert abgezogen und bei 570 nm mit einem Plattenlesegerät vom Typ Cytation 3 (AHDiagnostics) oder Hidex Sense (Hidex) auf Null gesetzt. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. P. aeruginosa wurde über Nacht in LB-Medium mit 1 % D-Glucose und A. baumannii – in LS-LB (0,5 % NaCl, 0,1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt) + 1 % D-Glucose kultiviert. Über Nacht wurde P. aeruginosa und A. baumannii-Kulturen wurden 1:100 in einer transparenten 96-Well-Platte mit 200 μl LB-Medium, das 1 % D-Glucose enthielt, verdünnt. Eine Konzentration von 1 mM P[5]a wurde aus einer 100-fachen Stammlösung oder einer äquivalenten Konzentration an destilliertem H2O hinzugefügt. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt und die Vertiefungen dreimal mit sterilem 1x PBS, einmal mit eiskaltem Methanol zur Fixierung des Biofilms gewaschen und trocknen gelassen. Eine 0,1 %ige Kristallviolettlösung (Sigma-Aldrich, > 90 %) wurde hinzugefügt, um den Biofilm 15 Minuten lang zu färben, gefolgt von drei Waschschritten mit destilliertem H2O, um ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Zur Auflösung des Biofilms wurde 96 % EtOH zugegeben und 30 Minuten unter leichtem Schütteln belassen. Anschließend wurde die Lösung in eine neue sterile 96-Well-Platte überführt und die OD570 gemessen.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 200 µL vorbereitet und in einer 96-Well-Platte (Corning) bei 20 °C gemessen. Von jeder Probe wurde der Leerwert abgezogen und bei 650 nm mit einem Plattenlesegerät vom Typ Cytation 3 (AHDiagnostics) oder Hidex Sense (Hidex) auf Null gesetzt. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. Die Bindungskonstanten wurden mit der Software Reactlab Equilibria® (Jplus Consulting) ermittelt und an die gemittelten Spektren jeder Probe zwischen 390 und 490 nm angepasst. Dissoziationskonstanten wurden als Kehrwert der Assoziationskonstanten berechnet. Vollständige Bindungsasymptoten wurden mit der Reactlab EQSIM2-Software (Jplus Consulting) mit den aus der Anpassung erhaltenen Parametern simuliert.

Bestimmung der MO-P5a-Bindungskonstante (k2): Eine konstante Konzentration von MO (2,0 × 10–6 M) wurde mit steigenden Mengen an P5a bei 0 und 50 mM NaCl titriert (Abb. S1a, b). Beide Wellenlängen unabhängiger Triplikate wurden erfolgreich an ein 1:1-Bindungsmodell angepasst (Abb. S1c).

Bestimmung der P5a-HSL-Bindungskonstante (k1): Eine Konzentration des MO-P5a-Komplexes wurde mit steigenden Mengen an HSLs titriert. Um die Komplexbildung sicherzustellen, wurden unterschiedliche Bedingungen bei 0 und 50 mM NaCl verwendet.

NaCl = 0 mM: [MO] = [P5a] = 2,0 × 10−6 M

NaCl = 50 mM: [MO] = 2,0 × 10−6 M; [P5a] = 1,0 × 10−5 M

Proben wurden durch Zugabe eines konstanten Volumens (2 µL) unterschiedlicher HSL-Konzentration in reinem DMSO zu 198 µL der oben genannten Lösungen hergestellt.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 200 µL vorbereitet und in einer 96-Well-Platte (Corning) bei 20 °C gemessen. Von jeder Probe wurde der Leerwert abgezogen und bei 695 nm mit einem Plattenlesegerät vom Typ Cytation 3 (AHDiagnostics) oder Hidex Sense (Hidex) auf Null gesetzt. Die Proben wurden in vierfacher Ausführung hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. PAO1-Kulturen über Nacht wurden 1:100 in 200 μl LB-Medium verdünnt. Unterschiedliche Konzentrationen von P[5]a wurden aus einer 100-fachen Stammlösung oder einer äquivalenten Konzentration an dH2O hinzugefügt. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Kulturflüssigkeit wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 16,3 × 1000 g gewonnen und durch 0,22 μm Spritzenfilter geleitet. Die zellfreie Lösung wurde in eine neue sterile 96-Well-Platte überführt und die OD695 gemessen.

Das fluoreszierende Reportersystem aus 6 E. coli-Stämmen, das 6 verschiedene HSLs erkennt (Abb. 1b), wurde in dieser Studie entwickelt, um Makrozyklen zu untersuchen, die die bakterielle Signalübertragung beeinflussen. Um die Reporterstämme zu erzeugen, wurde der E. coli-Stamm CY008 mit zwei Plasmiden transformiert (Ergänzungstabelle 2): eines mit einem Gen, das ein Rezeptorprotein kodiert, das für einen bestimmten HSL einzigartig ist, unter einem konstitutiven Promotor, und das zweite hat ein Gen für a fluoreszierendes Protein (EGFP für das Reportersystem; und EGFP, mKO2, CFP und mCherry für kombinierte mikrobielle Gemeinschaften) unter einem induzierbaren Promotor, der für das bestimmte HSL spezifisch ist. Das extern hinzugefügte HSL bindet an das Rezeptorprotein und löst dessen Dimerisierung aus. Bei der Dimerisierung bindet das Rezeptorprotein an den Promotor und aktiviert die Genexpression des fluoreszierenden Proteins.

Um die Makrocyclusinterferenz mit HSLs zu testen, wurden die Übernachtkulturen jedes Reporter-E.-coli-Stämmes 1:1000 verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,2 bei 37 °C unter Schütteln mit 220 U/min gezüchtet. Anschließend wurden die Kulturen auf die 96-Well-Platte übertragen und mit den entsprechenden HSLs (10–6 M) und 0–2,5 mM makrozyklischer Verbindung gemischt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Makrozyklen in 1X PBS gelöst (Ergänzungstabelle 1, letzte Spalte). Für die Makrozyklen, bei denen DMSO zur Löslichkeit erforderlich war, wurden die Endkonzentrationen im Assay bei 1 % gehalten. Die Platte wurde bei 37 °C unter Schütteln mit 180 U/min inkubiert. Die Extinktion OD600 und die Entwicklung des Fluoreszenzsignals wurden mit dem Cytation 3-Plattenlesegerät (BioTek) überwacht. Je stärker die Bindung zwischen Makrozyklus und HSL ist, desto weniger freie Signalmoleküle sind vorhanden, die die Fluoreszenzexpression in E. coli aktivieren können.

Die Wechselwirkungen der Makrozyklen mit den HSLs wurden durch Abnahme des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten nach 6 Stunden mit zugesetztem Makrozyklus (I1) und ohne Makrozyklus (I0) nachgewiesen.

Die E. coli-Stämme, die als Reaktion auf HSLs EGFP, mKO2, CFP und mCherry produzieren, wurden bei niedriger Flussrate in einem FACSTMAria III-System (BD Biosciences, San Jose, CA) unter Verwendung von 488 nm, 561 nm, 405 nm und 633 analysiert nm-Laser entsprechend. Für jede Probe wurden 10.000 Ereignisse gemessen. Die Daten für die Kanäle CFP/DAPI-A (450-40), GFP/FITC-A (530-30), mKO2/PE-A (582-15) und mCherry/PE-Cy5-A (670-14) waren als Pulsfläche erfasst und das Kompensationsverfahren wurde durchgeführt, um eine überlappende Signalerfassung zu vermeiden.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 200 µL vorbereitet und in einer 8-Well-Deckglaskammer (Nunc Lab-Tek) bei 20 °C gemessen. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. Biofilme der weitgehend resistenten P. aeruginosa-Isolate 2978, 5550, 5832 und 5842 wurden durch 24-stündige Kultivierung in 8-Well-Deckglaskammern (Nunc Lab-Tek), gefüllt mit LB-Medium mit 1 % D-Glucose, beginnend über Nacht, etabliert Kultur 1:100 verdünnt. Das Medium wurde entfernt und anschließend weitere 16 Stunden lang mit 45,2 µg P[5]a oder PBS behandelt, wie bereits berichtet59. Anschließend wurden die Biofilme mit Wasser gewaschen und FM1-43FX (Invitrogen) hinzugefügt, um die Bakterienzellmembran anzufärben. Der Biofilm wurde über Nacht bei 4 °C in 16 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 4,0 % Essigsäure in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) fixiert. Biofilme wurden mit einem Axio Observer Z1-Mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) sichtbar gemacht. Das grüne Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung von Anregungslicht bei 470 nm erhalten, während das emittierte Licht von 515–535 nm gesammelt wurde.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 200 µL vorbereitet und in einer 96-Well-Gewebekulturplatte (Corning) gemessen. Von jeder Probe wurde der Leerwert abgezogen und bei 600 nm unter Verwendung eines TC20-Zellzählers (BioRad) auf Null gesetzt. Die Proben wurden in biologischen Dreifachproben hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. Der Mastermix enthielt 450 µl DMEM-Medium (10 % FBS, 1x PenStrep, 1x Glutamax) und entweder 2,5 mM oder 100 µM P[5]a. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Experiment wurden die anhaftenden Zellen mit TrypLE (Thermo Fisher Scientific) behandelt und mit freien Zellen aus dem Überstand gemischt. Die gesammelten Zellen wurden 1:1 mit TrypanBlue (BioRad) gemischt und gezählt.

A549-Zellen wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Die Proben wurden in biologischen Dreifachproben hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. Vor dem Experiment wurden die Zellen mit TrypLE (Thermo Fisher Scientific) behandelt, aufgeteilt, gezählt und in 96-Well-Platten mit 50.000 Säugetierzellen pro Well aliquotiert. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 °C in DMEM mit den folgenden Zusätzen gezüchtet: 10 % fötales Rinderserum (Gibco), 1× PenStep (Sigma) und 1× GlutaMAX (Gibco). Anschließend wurden die Zellen mit PBS bei 37 °C gewaschen und für jede Bedingung 50 µL „Mastermix“ in jede Vertiefung gegeben. Der Mastermix enthielt 450 µl DMEM-Medium ohne Zusatzstoffe, CellTox Green Dye (CellTox™ Green Cytotoxicity Assay, Promega), entweder 2,5 mM oder 100 µM P[5]a. Die Fluoreszenz wurde mit einem Hidex Sense (Hidex)-Plattenlesegerät mit 490-nm-Anregungsquelle und einem 520-nm-Emissionsfilter abgelesen. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Endergebnisse basierten auf dem Unterschied in der Fluoreszenz zwischen 2-stündigen und 5-stündigen Messzeitpunkten. Der lineare Bereich und die Empfindlichkeit des Experiments wurden unter Verwendung von DMSO als toxischem Wirkstoff bestimmt.

A549-Zellen wurden wie im „Zytotoxizitätstest“ beschrieben gezüchtet und vorbereitet. Die Zellen wurden entweder mit i) 10 µM gereinigtem 3-Oxo-C12 HSL, ii) 100 µg gereinigtem LPS oder ii) 50 µl OD600 = 2 P. aeruginosa herausgefordert. Die Fluoreszenz wurde mit einem Hidex Sense (Hidex)-Plattenlesegerät mit 490-nm-Anregungsquelle und einem 520-nm-Emissionsfilter abgelesen. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Endergebnisse basierten auf dem Unterschied in der Fluoreszenz zwischen 2-stündigen und 5-stündigen Messzeitpunkten. Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder wurden mit einem Axio Observer Z1-Mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) aufgenommen. Das grüne Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung von Anregungslicht bei 470 nm erhalten, während das emittierte Licht von 515–535 nm gesammelt wurde. Das rote Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung von Anregungslicht bei 590 nm erhalten, während das emittierte Licht von 615–675 nm gesammelt wurde.

Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente wurden in einer analytischen Ultrazentrifuge Optima von Beckman Coulter durchgeführt. Alle Experimente wurden bei 20 °C unter Verwendung von Standard-2-Kanal-Mittelstücken in einem An-60 Ti-Rotor durchgeführt. P[5]a und Lipopolysaccharid aus Pseudomonas aeruginosa 10 (Sigma-Aldrich) wurden bei Konzentrationen von 75 µM bzw. 0,5 g L−1 gemessen. Die gemessene Mischung aus P[5]a und Lipopolysaccharid wurde durch Mischen von P[5]a und Lipopolysaccharid im Verhältnis 4:1 erhalten (Endkonzentration in der Mischung: 125 uM P[5]a und 0,5 g L−1 Lipopolysaccharid). Für alle Proben wurde 0,5 x PBS-Puffer verwendet. Experimente zur Sedimentationsgeschwindigkeit wurden im Absorptionsmodus bei Wellenlängen von 260, 290 und 305 nm und bei zwei Rotorgeschwindigkeiten durchgeführt: 25.000 und 60.000 U/min. Die Datenanalyse wurde mit der Software Sedfit und Ultrascan durchgeführt.

Für jede Probe wurde ein Gesamtvolumen von 300 µL vorbereitet und in Halbmikro-PMMA-Küvetten (Brandtech Scientific) bei 20 °C gemessen. Von jeder Probe wurde der Leerwert abgezogen und auf Null gesetzt. Der hydrodynamische Durchmesser (Dh) der Baugruppen wurde mit einem DLS-Gerät von Malvern Instruments (Zetasizer Nano ZS-Serie) mit einem 4 mW He-Ne-Ionenlaser bei einer Wellenlänge von 633 nm und einem Avalanche-Photodiodendetektor in einem Winkel von 173° gemessen. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt und der Durchschnitt und die Standardabweichung angezeigt. 100 mg L-1 gereinigtes LPS aus PA10 (Phenol-extrahiert) wurden in entweder 300 µL destilliertem H2O, 0,5x oder 1x PBS-Puffer gelöst und mit P[5]a (0,1–17,5 mg L-1) titriert, um den gewünschten Wert zu erreichen Verhältnis. Da die Volumenzugabe 5 % des gesamten Probenvolumens nicht überstieg, wurden keine Verdünnungskorrekturen berücksichtigt. Für die Titration von LPS-P[5]a-Komplexen (40 µM P[5]a) wurde eine 0,01–0,5 M NaCl-Lösung verwendet, um die gebildeten Komplexe zu zerlegen.

Die RNA aus A549-Zellen und P. aeruginosa PAO1 wurde mit einem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert, mit einer Methode vorbereitet und sequenziert, die auf dem Drop-seq-Protokoll60 basiert und in (Ergänzende Methoden zur Sequenzierung) näher beschrieben wird. Das Lese-Alignment und die RNA-seq-Datenanalyse werden weiter beschrieben in (Ergänzende Methoden, Lese-Alignment und RNA-seq-Datenanalyse).

1H-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance DRX 400-Spektrometer aufgezeichnet. 5 mM Stammlösungen der Rezeptoren (4-Sc[4]a, P[5]a und β-CD), der HSLs (C4, pC, 3-Oxo-C6, 3-Oxo-C12 und 3-OH- C14) wurden hergestellt. Reine Rezeptoren und HSLs wurden durch Zugabe von 250 µL Stammlösung zu 250 µL reinem Lösungsmittel (D2O oder LB) auf eine Probenkonzentration von 2,5 mM vorbereitet. Für 1:1-Wirt-Gast-Mischungen (Rezeptor-HSL) wurden 250 µL des Wirts und 250 µL der Gäste bei einer Konzentration von 2,5 mM sowohl des Wirts als auch der Gäste gemessen. Die Spektren wurden mit dem D2O-Signal als internem Standard kalibriert.

Alle Strukturen wurden durch Anwendung der Gaußschen 09-Programmreihe61 unter Verwendung des Minnesota M06-2X, einer hybriden metaGGA62-Austauschkorrelationsfunktion zusammen mit dem 6–311 G**-Basissatz von Pople, und dem integrierten Gleichungsformalismus-polarisierten Kontinuumslösungsmodell (IEFPCM) berechnet ), um Lösungsmitteleffekte zu berücksichtigen. Um die Auswahl dieses Basissatzes und Theorieniveaus sowohl für weitreichende als auch kurzreichweitige Wechselwirkungen innerhalb der Systeme weiter zu validieren, wurden alle Optimierungen unter Verwendung des langreichweitendispersionskorrigierten Funktionals (ωB97X-D)63,64 und wiederholt kombinierte Basissätze; LANL2DZ für Br und 6–311 G** für die übrigen Atome. Es wird berichtet, dass diese Theorieebene für die Modellierung von H-Brücken und dispersiven nichtkovalenten Wirt-Gast-Wechselwirkungen geeignet ist. Alle Minima wurden durch das Vorhandensein ausschließlich realer Schwingungsfrequenzen bestätigt. Thermochemische Größen wurden bei 298 K ausgewertet. Einzelpunktberechnungen wurden auch auf M062X/6-311 + G**-Niveau an für M062X/6-311 G** optimierten Geometrien durchgeführt. Die Strukturvisualisierung wurde mit GaussView v5.0.8.4 und Maestro 1165 durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Quantentheorie des Atoms im Molekül (QTAIM) für eine topologische Analyse der Schlüsselwechselwirkungen innerhalb des Hohlraums eines Wirts und ihrer Dichteeigenschaften angewendet AIM2000-Software. Die Ladungsverteilung wurde mithilfe einer MESP-Karte (Molecular Electrostatic Potential Surface) analysiert.

Um die Beziehung zwischen der Struktur und Aktivität verschiedener Wirt-Gast-Systeme zu untersuchen, wurden das molekulare elektrostatische Potential (MEP) und die MESP-Verschiebung, die nützlichste elektrostatische Eigenschaft, untersucht. Die elektrostatischen Potentialverschiebungen der Moleküloberfläche für die Wirt-Gast-Komplexe wurden als wertvolles Erkennungsinstrument bei der Wirt-Gast-Zusammensetzung berechnet, wobei der Dichtewürfel von P[5]a, Gastfragmenten und Komplexen berechnet wurde, um eine Isooberfläche zu erzeugen. Anschließend haben wir die Werte der ESP-Verschiebung innerhalb des Komplexes auf diese Isoflächen abgebildet. Die Molekülorbitale (HOMO und LUMO) des Komplexes aufgrund der Bindung verschiedener Liganden (3-OH-C14, 3-Oxo-C12, 3-Oxo-C6) in der P[5]a-Bindungstasche wurden am berechnet M062X/6-311 G**-Niveau.

Um die wichtigsten intermolekularen Wechselwirkungen weiter zu bewerten, wurde die QTAIM-Analyse angewendet. Eine topologische Analyse der Elektronendichte wurde mit Baders Quantentheorie der Atome in Molekülen (QTAIM) unter Verwendung der Software AIM2000 durchgeführt.

Die MHKs aktiver Bakterienkulturen in Gegenwart von Antibiotika und/oder P[5]a wurden mithilfe des Mueller-Bouillon-Mikroverdünnungstests gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)37 bestimmt. Die Tests wurden in Polystyrol-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (NUNC) mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Kurz gesagt, eine einzelne Kolonie wurde in 5 ml LB-Medium inokuliert und in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bis zur endexponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Anschließend wurden die Kulturen in frischem LB-Medium auf eine OD600 (optische Dichte) von 0,002 (entspricht 1 × 108 KBE ml−1) verdünnt. 100 μl LB-Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an Antibiotika und gegebenenfalls in P[5]a wurden in einer sterilen 96-Well-Platte seriell verdünnt. Anschließend wurden 100 μL der verdünnten Bakterien in 96-Well-Platten pipettiert. In jeder Platte wurden die gewachsenen Bakterien mit der maximalen Konzentration an Träger und Medium als Positiv- bzw. Negativkontrolle betrachtet. Die 96-Well-Platten wurden dann über Nacht bei 37 °C statisch inkubiert, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.

Die Fähigkeit eines anfälligen P. aeruginosa-Laborstamms, eine Resistenz gegen P[5]a zu entwickeln, wurde mithilfe einer Adaption einer mehrstufigen Resistenzstudie durch wiederholte tägliche Subkultivierung in Gegenwart von P[5]a über einen Zeitraum von 14 Tagen bewertet. Kurz gesagt, P. aeruginosa O1-Kulturen wurden über Nacht mit 1 mM P[5]a in LB-Medium gezüchtet, dann wurde die OD der Bakterien auf einen OD600 von 0,002 eingestellt. Bakterienzellen wurden 24 Stunden lang unter ständigem Rühren kultiviert. Anschließend wurde die Kulturflüssigkeit durch 15-minütige Zentrifugation bei 16,3 × 1000 g gewonnen. Kulturflüssigkeiten wurden durch spritzenbetriebene 0,22-μm-Filter geleitet. Die zellfreie Lösung wurde auf eine neue sterile 96-Well-Platte übertragen und die OD695 wurde mit einem Cytation 3-Plattenlesegerät (AHDiagnostics) gemessen. Die Kulturen wurden für eine anschließende Verdünnung mit frischem P[5]a verwendet.

Die Fähigkeit eines anfälligen P. aeruginosa-Laborstamms, in Gegenwart oder Abwesenheit von P[5]a eine Antibiotikaresistenz zu entwickeln, wurde mithilfe einer mehrstufigen Resistenzstudie durch wiederholte tägliche Subkultivierung in Gegenwart des halben MHK-Werts der aktiven Antibiotikakonzentration bewertet . Dies wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen gemäß den CLSI-Richtlinien durchgeführt. Kurz gesagt, P. aeruginosa O1-Kulturen wurden in Mueller-Brühe-Medium gezüchtet, dann wurde die OD der Bakterien auf einen OD600 von 0,002 eingestellt. Bakterienzellen wurden vom Aggregator bei halber MHK-Konzentration behandelt; Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die MHKs durch einen Mikroverdünnungstest getestet.

Diese Studie unterliegt der Gesetzgebung des italienischen Gesetzesdekrets Nr. 26/2014 und der europäischen Richtlinie Nr. 2010/63/UE. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der nationalen Gesetzgebung, mit Genehmigung des internen Aptuit-Ausschusses für Tierforschung und Ethik und mit Genehmigung des italienischen Gesundheitsministeriums (Autorisierungsprojekt des italienischen Gesundheitsministeriums – Interner Code Nr. 30004-B64) durchgeführt. Die allgemeinen Verfahren für die Pflege und Unterbringung von Tieren entsprechen den aktuellen Empfehlungen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Das Geschlecht wurde im Studiendesign berücksichtigt. Für diese Studie wurden nur weibliche Mäuse ausgewählt, da männliche Mäuse als Reaktion auf Immunherausforderungen durch Lipopolysaccharide größere Schwankungen der Körpertemperatur und des Krankheitsverhaltens zeigen66. Für das LPS-induzierte Lungenentzündungsmodell wurden 8 Wochen alte weibliche C57BL/6 J-Mäuse (Charles River, Frankreich) verwendet.

Intratracheale P[5]a-Verabreichung

Alle Tiere wurden anästhesiert (4,0–4,5 % Isofluran; 2 l/min O2) und auf einen abgewinkelten Dosiertisch gelegt, der sich in einem Abzug befand. Die Tiere wurden auf dem Rücken positioniert und mit den beiden oberen Zähnen an einem Draht aufgehängt. Die Zungen der Tiere wurden vorsichtig mit einer Pinzette zur Seite herausgezogen. Eine mit einem PE 100-Schlauch verbundene Kanüle und eine 100-µl-Hamilton-Spritze wurden in die Luftröhre eingeführt. 50 µl Vehikel oder P[5]a wurden in die Lunge dosiert. Die Tiere wurden einige Sekunden lang in aufrechter Position gehalten, bevor sie in ihren Heimkäfig zurückgebracht wurden.

Intranasaler LPS-Challenge

Eine Stunde nach der Verabreichung von Vehikel oder P[5]a wurden alle Tiere anästhesiert (4,0–4,5 % Isofluran; 2 l/min O2). Sobald ein ausreichendes Anästhesieniveau erreicht war, wurde den Tieren mit einer P100-Pipette (Gilson) LPS (50 µl/Maus) verabreicht. Die Tiere wurden nach der Dosierung für kurze Zeit aufrecht gehalten, um eine Verteilung der Substanz über die Atemwege zu ermöglichen. Die Tiere wurden dann in einen Erholungskäfig gesetzt und, sobald sie wieder bei vollem Bewusstsein waren, in ihren Heimkäfig zurückgebracht.

BALF-Sammlung und Anzahl der Entzündungszellen

Vier oder vierundzwanzig Stunden nach der Belastung wurden die Tiere mit einer Kombination aus Isofluran und einer intraperitonealen Injektion von Thiopental-Natrium (300 mg/kg) getötet. Die Luftröhre wurde freigelegt und eine mit einer Spritze verbundene Führungskanüle eingeführt. Die Lungen wurden dreimal mit 0,4 ml PBS gewaschen. Das gewonnene BALF wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 800 xg zentrifugiert. Die Pellets wurden in 200 µl PBS resuspendiert und die Zellen wurden unter Verwendung eines automatischen Zellzählers (Dasit) gezählt. Der BALF-Überstand wurde aliquotiert und zur anschließenden Analyse der Mediatorspiegel bei –80 ° C gelagert.

Analyse von Entzündungsmediatoren in BAL-Flüssigkeit.

Die Quantifizierung von IL-1β, IL-6, VEGF-A, MIP-1α, MIP-2, TNFα, KC, IL-17A und MCP-1 erfolgte mithilfe eines auf Elektrochemilumineszenz basierenden Immunoassays (MSD-Technologie) gemäß den Anweisungen im Kit enthalten. MSD-Platten wurden mit einem Meso Sector S 600 gelesen.

Datenverarbeitung und -analyse.

Die Wirkung der über den it-Weg dosierten Wirkstoffe wurde gegen LPS-induzierte Lungenentzündung (Neutrophilie) 4 und 24 Stunden nach der Belastung bewertet. Die erhaltenen Daten werden als Mittelwert +/- SEM dargestellt und in Diagrammen visualisiert. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 8 von One Way ANOVA durchgeführt, gefolgt vom Dunnetts-Test „Mehrfachvergleichstest“.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Haupttext und in der Datei mit ergänzenden Informationen verfügbar. Daten sind auf Anfrage auch beim entsprechenden Autor erhältlich. Die in dieser Studie generierten RNA-Sequenzierungsdaten der A549-Epithelzellen wurden hinterlegt und sind in der NCBI Gene Expression Omnibus-Datenbank unter dem Zugangscode GEO Submission GSE182853 verfügbar. Die in dieser Studie generierten RNA-Sequenzierungsdaten von Pseudomonas aeruginosa wurden hinterlegt und sind in der NCBI Gene Expression Omnibus-Datenbank unter dem Zugangscode GEO Submission GSE182847 verfügbar. Die optimierten Strukturdaten für alle in dieser Studie generierten Verbindungen wurden als Gaußsche Eingabedateien hinterlegt und sind in der Borealis-Datenbank unter dem Zugangscode VF7T7J [https://doi.org/10.5683/SP3/VF7T7J] verfügbar.

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Die Autoren danken der Academy of Finland für die Finanzierung durch ihr Centre of Excellence Program Life-Inspired Hybrid Materials (LIBER-Stipendium 346105, 346109, 346110, 2022-2029: CJ, EO, MAK, RHAR, MBL) und Academy Projects ( Zuschuss 272578: und 272579: CJ, EO, MBL, NKB, RHAR) sowie Research to Business-Förderung von Business Finland (Projektnummern 6764/31/2019: CJ, EO, MBL und 6768/31/2019: KL, PS). Wir bedanken uns für die Unterstützung der Oakland University, MI, USA. Wir möchten auch dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Zuschuss 2018-06338: SMT, JFT) und dem Canadian Tricouncil (NFRFE-2018-00075: SMT, JFT) danken. SMT und JFT möchten anerkennen, dass diese Arbeit durch die Einrichtungen des Shared Hierarchical Academic Research Computing Network (SHARCNET: www.sharcnet.ca) und Compute/Calcul Canada ermöglicht wurde. Der RNAseq-Sequenzierungsdienst wurde von der Biomedicum Functional Genomics Unit am Helsinki Institute of Life Science und dem Biocenter Finland der Universität Helsinki bereitgestellt. Wir möchten Dr. A. Bragonzi für die klinischen CF-Isolate von P. aeruginosa danken. Wir möchten uns auch bei Dr. A. Pätäri-Sampo für die klinischen Isolate von P. aeruginosa und A. baumannii vom Helsinki University Hospital (HUS) bedanken. Wir danken S. Soidinsalo für die ausführlichen Diskussionen und Beiträge.

Aalto University, School of Chemical Engineering, Department of Bioproducts and Biosystems, Kemistintie 1, 02150, Espoo, Finnland

Christopher Jonkergouw, Ekaterina Osmekhina, Dmitry Fedorov, Eduardo Anaya-Plaza, Mauri A. Kostiainen, Robin HA Ras und Markus B. Linder

Oakland University, Department of Chemistry, 146 Library Drive, Rochester, MI, 48309-4479, USA

Ngong Kodiah Beyeh

Aalto-Universität, School of Science, Abteilung für Angewandte Physik, Puumiehenkuja 2, Espoo, Finnland

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Universität Helsinki, Translational Immunology Research Program, Haartmaninkatu 8, 0014, Helsinki, Finnland

Katarzyna Leskinen & Päivi Saavalainen

University of Windsor, Department of Chemistry and Biochemistry, Windsor, ON, N9B 3P4, Kanada

S. Maryamdokht Taimoory und John F. Trant

University of Michigan, Department of Chemistry, Ann Arbor, MI, USA

S. Maryamdokht Taimoory

Public Health Institute of Genetics, Public Health Research Center, Helsinki, Finnland

Päivi Saavalainen

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Konzeptualisierung, CJ, NKB, EO, RHAR und MBL; Methodik, CJ, EAP, NKB, EO, KL, DF, SMT und JFT; Analyse, CJ, NKB, EO, KL, SMT, EAP, MAK, DF, JFT, RHAR, PS und MBL; Schreiben, CJ, NKB, JFT, RHAR, KL und MBL; Überprüfung und Bearbeitung, JFT, RHAR, PS und MBL

Korrespondenz mit Christopher Jonkergouw, Päivi Saavalainen oder Markus B. Linder.

Die Aalto-Universität hat zusammen mit der Universität Helsinki die Patentanmeldungen FI20185841A1, FI20205369A1 und FI20205368A1 zu den Auswirkungen von Makrozyklen auf gramnegative Krankheitserreger eingereicht, mit CJ, NKB, EO, KL, RHAR, PS und MBL als Miterfindern. CJ, EO und KL sind Mitbegründer von Arivin Therapeutics Oy. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf die Gestaltung oder Sammlung der Ergebnisse, die Interpretation der Daten oder das Verfassen des Manuskripts. Die übrigen Autoren geben keine weiteren Interessenkonflikte an.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jonkergouw, C., Beyeh, NK, Osmekhina, E. et al. Umnutzung der Wirt-Gast-Chemie zur Sequestrierung der Virulenz und Beseitigung von Biofilmen in multiresistenten Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii. Nat Commun 14, 2141 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37749-6

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Eingegangen: 15. August 2022

Angenommen: 29. März 2023

Veröffentlicht: 14. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37749-6

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