Cyclodextrincarboxylat verbessert die Stabilität und Aktivität von Nisin in einem breiteren Spektrum von Anwendungsbedingungen

npj Science of Food Band 7, Artikelnummer: 20 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Nisin ist ein natürliches Bakteriozin, das eine gute antibakterielle Wirkung gegen grampositive Bakterien aufweist. Unter sauren Bedingungen weist es eine gute Löslichkeit, Stabilität und Aktivität auf, wird jedoch weniger löslich, stabil und aktiv, wenn der pH-Wert der Lösung 6,0 übersteigt, was den industriellen Anwendungsbereich von Nisin als antibakterielles Mittel stark einschränkt. In dieser Studie untersuchten wir das Potenzial der Komplexierung von Nisin mit einem Cyclodextrincarboxylat, Bernsteinsäure-β-Cyclodextrin (SACD), zur Überwindung der Nachteile. Zwischen Nisin und SACD wurde eine starke Wasserstoffbrückenbindung nachgewiesen, die die Bildung von Nisin-SACD-Komplexen fördert. Diese Komplexe zeigten eine gute Löslichkeit unter neutralen und alkalischen Bedingungen und eine gute Stabilität, nachdem sie während der Verarbeitung mit Hochdampfsterilisation bei hohen pH-Werten gehalten wurden. Darüber hinaus zeigten die Nisin-SACD-Komplexe eine deutlich verbesserte antibakterielle Aktivität gegen grampositive Modellbakterien (S. aureus). Diese Studie zeigt, dass die Komplexierung die Wirksamkeit von Nisin unter neutralen und alkalischen Bedingungen verbessern kann, was seinen Anwendungsbereich in der Lebensmittel-, Medizin- und anderen Industriezweigen erheblich erweitern kann.

Nisin ist ein kleines Peptid, das aus 34 Aminosäureresten besteht und vom Stamm der Unterart Lactococcus lactis produziert wird. Dabei handelt es sich um das einzige Bakteriocin, das als Lebensmittelkonservierungsmittel zugelassen ist1. Es gilt allgemein als sicher (GRAS) und wird häufig in der Lebensmittel-, Medizin- und Agrarindustrie eingesetzt. Nisin zeigt eine antibakterielle Breitbandaktivität gegen grampositive Bakterien. Es wird angenommen, dass es an den Zellmembranen von Bakterien adsorbiert, diese zerstört und die Freisetzung interner Zellsubstanzen verursacht, wodurch der Zelltod gefördert wird2,3. Unter sauren Bedingungen (pH < 6,0) zeigt Nisin die gewünschte Löslichkeit und Stabilität mit nur einem geringen Aktivitätsverlust nach der Wärmebehandlung4,5. Allerdings verändert sich die Struktur von Nisin unter alkalischen Bedingungen aufgrund einer intermolekularen nukleophilen Additionsreaktion, was zu einer verminderten Wasserlöslichkeit, thermischen Stabilität und antibakteriellen Aktivität führt6,7. Daher ist die industrielle Anwendung von Nisin als natürliches antimikrobielles Mittel derzeit auf saure Bedingungen beschränkt.

Der pH-Wert der meisten physiologischen Flüssigkeiten liegt im Bereich von 6,0–8,5, einschließlich intrazellulärer, extrazellulärer und intestinaler Flüssigkeiten8. Um die industriellen Anwendungen von Nisin zu erweitern, wurden daher Anstrengungen unternommen, Strategien zu identifizieren, um seine Löslichkeit, Stabilität und antibakterielle Aktivität unter physiologischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Organische Säuren können sich in wässrigen Lösungen durch Wasserstoffbrücken mit Nisin verbinden, was die Leistung von Nisin steigern kann. Beispielsweise haben Adhikari et al. 7 zeigte, dass ein Nisin-organische Säure-Komposit bei pH 8,0 eine viel höhere antimikrobielle Aktivität aufwies als reines Nisin. Es wurde auch gezeigt, dass die Verwendung einer Kombination von Nisin mit EDTA die antibakterielle Aktivität von Nisin9 erhöht, was auf die Fähigkeit des Chelatbildners zurückgeführt wurde, die Permeabilität der Bakterienzellwände zu erhöhen. Es gab jedoch keine offensichtliche Verbesserung der Stabilität des Nisins. Andere Bemühungen, die darauf abzielen, die Stabilität von Nisin zu verbessern, basieren in der Regel auf Nanoabgabesystemen, die aus Biopolymeren wie Chitosan, Cellulose und Pektin hergestellt werden3,10,11. Der Aufbau dieser Abgabesysteme ist jedoch oft kompliziert, kostspielig und schwierig zu skalieren, was ihre industrielle Anwendung einschränkt. Daher wäre es von Vorteil, eine einfache und kostengünstige Methode zu entwickeln, die den praktischen industriellen Anforderungen gerecht wird.

Cyclodextrine (CDs) sind zyklische Oligosaccharide, die aus unterschiedlich vielen α-D-Glucopyranose-Einheiten bestehen, durch enzymatische Hydrolyse aus Stärke hergestellt werden und in den meisten Regionen der Welt für die Verwendung in Lebensmitteln und Gesundheitsprodukten zugelassen sind12. Die zyklische Natur von CDs führt zur Bildung von Molekülen mit einem hydrophoben Kern und einer hydrophilen Außenseite, wodurch sie als Wirtsmoleküle für den Einbau unpolarer Gastmoleküle oder -einheiten geeignet sind13. Die Einkapselung bioaktiver Verbindungen in CDs verbessert häufig deren Wasserdispergierbarkeit, erhöht ihre Beständigkeit gegenüber Hitze, Licht und Sauerstoff und ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung14,15. Zuvor haben Forscher gezeigt, dass die Einkapselung von Nisin in β-CDs seine antibakterielle Aktivität während der Konservierung von gekochtem Schweinefleisch verbesserte16, was auf die Bildung von Nisin-CDs-Komplexen zurückgeführt wurde, die die Mikroumgebung von Nisin veränderten. Es besteht jedoch weiterhin Bedarf an einer alternativen Form von CD, die gleichzeitig die Löslichkeit, Stabilität und antimikrobielle Aktivität von Nisin verbessern kann.

Unter den in der Lebensmittelindustrie häufig verwendeten Cyclodextrinen zeichnet sich β-CD durch geringe Kosten und eine starke Bindungsaffinität zu hydrophoben Gastsubstanzen aus. Allerdings reicht seine Wasserlöslichkeit (ca. 1,85 %) für viele kommerzielle Anwendungen nicht aus17. Die zur Verbesserung der Löslichkeit von Nisin verwendete β-CD-Dosis war daher in praktischen Systemen begrenzt. β-CD-Derivate, die häufig in kommerziellen pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden, einschließlich Hydroxypropyl-β-CD (HP-β-CD), Sulfobutylether-β-CD (SBE-β-CD) und Methyl-β-CD (M-β-CD). ) zeigen nach chemischer Modifikation eine deutlich verbesserte Wasserdispersität17,18. Es werden auch neue Strategien zur Herstellung von Cyclodextrin-Derivaten in Lebensmittelqualität erforscht. Beispielsweise wurden Octenyl- und Octadecenylbernsteinsäureanhydride an die Hydroxylgruppen von Cyclodextrinmolekülen gebunden, um Derivate mit guten Emulgiereigenschaften herzustellen19,20. Allerdings können derart große Substituenten an β-CD aufgrund sterischer Hinderungseffekte dessen Fähigkeit zum Einbau von Gastmolekülen beeinträchtigen. In unserer vorherigen Studie wurde ein Cyclodextrin-Derivat, Bernsteinsäure-β-Cyclodextrin (SACD), erhalten und erwies sich als mehr als 50-fach besser wasserdispergierbar als β-CD. Mittlerweile weist SACD ein deutlich höheres Komplexierungsverhalten gegenüber Gastmolekülen auf21. Die Modifikation erfolgte nach einem einfachen und sicheren chemischen Trockenerhitzungsverfahren, bei dem alle verwendeten Chemikalien lebensmittelecht waren. Das erhaltene SACD hat sich als nicht zytotoxisch erwiesen, was eine vielversprechende Strategie zur Verbesserung der Löslichkeit und Bioaktivität von Nisin sein könnte.

In dieser Studie wollten wir die Löslichkeit und antibakterielle Aktivität von Nisin durch die Bildung von Komplexen mit SACD verbessern. Die molekularen Wechselwirkungen zwischen Nisin und SACD wurden durch die Analyse der molekularen und kristallinen Strukturen der Komplexe aufgeklärt. Die Wasserlöslichkeit und Stabilität des Nisin-SACD-Komplexes wurden gemessen. Darüber hinaus wurde die antibakterielle Aktivität von Nisin-SACD-Komplexen gegen einen grampositiven, durch Lebensmittel übertragenen Modellpathogen (S. aureus) aufgeklärt.

Um die Wechselwirkungen zwischen Nisin und SACD aufzudecken, die die Bildung von Nisin-SACD-Komplexen vorantreiben, wurde eine FTIR-Analyse verwendet, um die chemischen Eigenschaften von komplexiertem Nisin-SACD mit Nisin, SACD und der physikalischen Mischung von Nisin und SACD (PM Nisin+) zu vergleichen SACD) (Abb. 1a). Die molekularen Wechselwirkungen zwischen Nisin und SACD wurden anhand der FTIR-Spektren veranschaulicht. Der breite Peak bei etwa 3369 cm−1 wurde der O-H-Streckschwingung der SACD-Moleküle zugeschrieben. Der Peak bei 1732 cm−1 wurde der C=O-Streckung der Esterbindungen von SACD zugeschrieben. Die charakteristischen Banden bei 2929, 1155 und 1027 cm−1 wurden den CH2-, C-O-C- und C-OH-Gruppen von SACD zugeordnet. Die breite Spitzenabsorptionsbande von Nisin bei 3440 cm−1 wurde auf axiale O-H/N-H-Streckschwingungen zurückgeführt, die Bande bei 2923 cm−1 wurde auf die Streckschwingung von C-H zurückgeführt und die Bande bei etwa 1630 cm−1 wurde auf die Absorption durch die Amidgruppe zurückgeführt22. Nach der Komplexierung mit SACD verschob sich die O-H- und N-H-Bande deutlich zu einer niedrigeren Wellenzahl (3269 cm−1), mit einer Wellenzahlverschiebung von −127 bzw. −171 cm−1 im Vergleich zu SACD und Nisin . Unterdessen wurde eine Rotverschiebung von 10 cm−1 an der Ester-C=O-Bande für das Nisin-SACD bei 1722 cm−1 beobachtet. Die obigen Phänomene weisen darauf hin, dass zwischen Nisin und SACD eine starke Wasserstoffbindung stattgefunden hat. Vermutlich spielten Bernsteinsäurezweige an den SACD-Molekülen eine wichtige Rolle bei diesen Wechselwirkungen. Andere Forscher haben ebenfalls über starke Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ähnlichen Komponenten in Komplexen berichtet23,24. Die Amidbande wurde im Spektrum der Nisin-SACD-Komplexe nicht beobachtet, was auf die Abschirmwirkung von SACD aufgrund des relativ geringen Nisinanteils im Komplex zurückzuführen sein könnte. Das FTIR-Spektrum der physikalischen Mischung aus Nisin + SACD stimmte mit einer Kombination der beiden Einzelkomponenten überein, ohne dass offensichtliche Bandenverschiebungen beobachtet wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass in den einfachen physikalischen Mischungen von Nisin und SACD keine Komplexierung auftrat.

FTIR-Spektren (a) und XRD-Spektren (b) von SACD, Nisin, Nisin-SACD und einer physikalischen Mischung aus Nisin und SACD (PM Nisin+SACD).

Es ist bekannt, dass die Bioverfügbarkeit bioaktiver Substanzen direkt mit ihrer Dispersität in Matrizen korreliert. In der pharmazeutischen Industrie gilt die physikalische Umwandlung der bioaktiven Substanzen vom kristallisierten in den amorphen Zustand als wirksame Methode zur Verbesserung ihrer Dispersität in Matrizes25. In früheren Studien wurden CDs häufig mit vielen hydrophoben bioaktiven Verbindungen, einschließlich Nutrazeutika und Pharmazeutika, komplexiert. Nach der Komplexierung wandelte sich der physikalische Zustand bioaktiver Verbindungen von der kristallisierten Struktur in eine amorphe Form mit deutlich erhöhter Löslichkeit um, was zu einer effektiv verbesserten Bioverfügbarkeit und Bioaktivität der Verbindungen beitrug26,27,28. Daher wurde in dieser Studie die Kristallstruktur von Nisin nach der Komplexierung mit SACD mithilfe eines Röntgendiffraktometers analysiert, um die Aktivität von Nisin-SACD-Komplexen vorherzusagen. Nisin zeigte Beugungspeaks bei 2θ-Werten von 27,4° und 31,7° (Abb. 1b), was mit früheren Studien übereinstimmt29. Für SACD wurden keine deutlichen Beugungspeaks beobachtet, was darauf hindeutet, dass SACD eine amorphe Struktur aufweist21. Nach der Komplexierung von Nisin mit SACD konnte nur eine geringfügige Veränderung beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass Nisin in den Nisin-SACD-Komplexen in amorpher Form vorlag. Daher spekulierten wir, dass die amorphe Natur der Nisin-SACD-Komplexe die biologische Aktivität des Nisins erhöhen würde. Zum Vergleich zeigte die physikalische Mischung aus Nisin + SACD eine einfache Kombination von Beugungsmustern von Nisin und SACD, einschließlich der scharfen kristallinen Peaks von Nisin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Nisin in den physikalischen Mischungen in kristalliner Form verblieb, was ein weiterer Beweis für die erfolgreiche Bildung von Nisin-SACD-Komplexen ist.

Die Komplexierung von Nisin und SACD führt zu Veränderungen in der molekularen Anordnung und den Wechselwirkungen des Nisins, was sich auf seine thermische Stabilität auswirken könnte. Daher wurde eine thermogravimetrische Analyse durchgeführt, um das Massenänderungsverhalten von Nisin-SACD-Komplexen und -Mischungen während des kontrollierten Erhitzens zu bewerten. Im Allgemeinen wurde der unter 100 °C beobachtete Gewichtsverlust der ersten Stufe auf die Verdunstung von Feuchtigkeit in den Proben zurückgeführt. Wie in Abb. 2a gezeigt, gab es im Frühstadium unter 100 °C keinen offensichtlichen Gewichtsverlust von Nisin, was darauf hindeutet, dass aufgrund seiner geringen Hydrophilie bei neutralem pH-Wert nur wenig Wasser im pulverisierten Nisin eingeschlossen war. Darüber hinaus wurde bei Nisin am Ende des Erhitzungsprozesses (600 °C) nur ein geringer Gewichtsverlust (<7 %) beobachtet, was auf seinen hohen Kristallinitätsgrad zurückzuführen sein könnte. Andere Forscher haben über eine ähnliche Stabilität von Nisin unter Trockenerhitzungsbedingungen berichtet30.

Die TG- (a) und dTG-Kurven (b) von Nisin, Nisin-SACD, PM-Nisin + SACD und SACD.

Für SACD wurden in den TG-Kurven zwei unterschiedliche Phasen des Massenverlusts während des Erhitzens beobachtet. Die erste Stufe wurde auf die Verdunstung von Feuchtigkeit aufgrund der Anwesenheit von in der hydrophilen Struktur von SACD eingeschlossenen Wassermolekülen zurückgeführt, die zu etwa 4,5 % des Gesamtgewichtsverlusts beitrug. Am Ende des Erhitzens waren bei dieser Probe fast 67 % Gewichtsverlust eingetreten, was hauptsächlich auf den thermischen Abbau der SACD-Moleküle bei etwa 300 °C und höher zurückzuführen war.

Bei Nisin-SACD-Komplexen war der Feuchtigkeitsverlust während der ersten Erhitzungsstufe etwas geringer als bei reinem SACD, was möglicherweise daran liegt, dass ein gewisser Anteil der Hydroxyl- und Carboxylgruppen am SACD durch Nisin besetzt war und daher für Wassermoleküle nicht verfügbar war zu adsorbieren. Auch bei etwa 300 °C kam es zu einem steilen Massenabfall, der hauptsächlich auf den thermischen Abbau des SACD zurückzuführen war. Bei höheren Temperaturen war die Geschwindigkeit des thermischen Abbaus bei den Nisin-SACD-Komplexen schneller als bei reinem SACD, was möglicherweise daran lag, dass die molekularen Kräfte schwächer waren.

Im Vergleich zu Nisin-SACD-Komplexen zeigte sich am Ende des Erhitzungsprozesses ein geringerer Gewichtsverlust der physikalischen Mischung aus Nisin und SACD. Dies könnte daran liegen, dass der freie Nisin-Anteil eine äußerst stabile Kristallstruktur aufweist. Dies legt nahe, dass die Stabilität der Proben bei Trockenerhitzung spezifische intermolekulare Reaktionen in Nisin-SACD-Komplexen widerspiegelt und beweist. Die Ergebnisse korrelierten jedoch nicht direkt mit der biologischen Aktivität von Nisin, da eine Änderung der Peptidstruktur auch bei einem unbedeutenden Massenverlust auftreten konnte31.

Um den Trockenerhitzungsprozess besser zu verstehen, wurden die Massenänderungsratenkurven der Proben aus den TG-Kurven berechnet (Abb. 2b). Die Temperaturen, bei denen der schnellste thermische Abbau stattfand, konnten in den resultierenden dTG-Profilen leicht beobachtet werden. Der maximale Zersetzungspeak von Nisin trat bei 333 °C auf, was darauf hindeutet, dass eine kleine Menge schwach kristallisiertes Nisin bei dieser Temperatur abgebaut wurde. Der maximale Zersetzungspeak von SACD trat bei 326 °C auf, wobei der größte Teil dieser Substanz bei dieser Temperatur abgebaut wurde. Für den Nisin-SACD-Komplex wurde eine niedrigere Zersetzungstemperatur von 317 °C beobachtet, was mit schwächeren molekularen Kräften in ihren amorphen Strukturen vereinbar ist. Interessanterweise wurde bei den Nisin-SACD-Komplexen ein breiter Peak bei etwa 504 °C beobachtet, was möglicherweise auf den fortschreitenden thermischen Abbau des SACD in den Komplexen zurückzuführen ist. Die physikalischen Mischungen aus Nisin und SACD zeigten eine maximale Zersetzungsrate bei etwa 337 °C, was auf den thermischen Abbau des SACD zurückgeführt wurde.

Die Löslichkeit und das Komplexierungsverhalten von Nisin und SACD wurden durch UV-Vis-Spektrenanalyse untersucht (Abb. 3). Die maximale Absorption von reinem Nisin lag bei etwa 201 nm, was mit der Sekundärstruktur des Peptidrückgrats zusammenhängt32. Allerdings konnte dieser Peak in den UV-Spektren nicht beobachtet werden, da die Nisinkonzentration zu niedrig war. Für das SACD wurde ein Peak bei 280 nm beobachtet, der mit der Absorption ungesättigter Zweige auf den SACD-Molekülen in Zusammenhang gebracht werden kann33. Nach der Komplexierung mit SACD nahm die Absorption von Nisin in wässrigen Lösungen mit zunehmender SACD-Konzentration deutlich zu. Dies deutet auf eine allmählich erhöhte Löslichkeit von Nisin hin. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass Nisin unter sauren Bedingungen löslich ist. Es wurde beobachtet, dass die Löslichkeit von Nisin durch SACD bei pH 2,0 sogar signifikant zunahm (Abb. 3a), was auf das Auftreten einer Mikroumgebungsveränderung von Nisin schließen lässt. Die maximale Absorptionswellenlänge verschob sich mit steigenden SACD-Konzentrationen allmählich von 201 auf 204 nm. Ein solches Rotverschiebungsphänomen zeigt eine erhöhte hydrophobe Wechselwirkungskraft zwischen Nisin und SACD, was zu einer verstärkten Nichtpolarität von Nisin in der Umgebung beiträgt. Als der pH-Wert auf 5,8 anstieg, zeigte die Absorption von Nisin in Lösungen bei gleicher SACD-Konzentration höhere Werte (Abb. 3b). Die maximale Absorption von Nisin verschob sich mit steigender SACD-Konzentration allmählich auf 207 nm. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Komplexierung von Nisin und SACD mit steigendem pH-Wert stärker wurde. Intensivere Wechselwirkungen zwischen den beiden Komponenten konnten bei pH 7,4 und 8,0 beobachtet werden, die als weniger vorteilhafte Bedingungen für die Solubilisierung von Nisin bekannt waren5. In beiden alkalischen Situationen wurde ein noch höheres Rotverschiebungsphänomen bis 211 nm beobachtet (Abb. 3c, d). Obwohl die maximale Absorption von Nisin leicht abnahm, blieb die Löslichkeit von Nisin im Vergleich zu reinem Nisin in den beiden alkalischen Situationen immer noch auf einem hohen Niveau.

Die UV-sichtbaren Spektren von Nisin-SACD mit verschiedenen SACD-Konzentrationen (2, 4, 6, 8 und 10 mg/ml) bei pH 2,0 (a), pH 5,8 (b), pH 7,4 (c) und pH 8,0 (d); die Löslichkeitsanpassungskurve von Nisin-SACD bei pH 2,0 (e), pH 5,8 (f), pH 7,4 (g) und pH 8,0 (h); und die UV-sichtbaren Spektren von freiem Nisin und komplexiertem Nisin mit SACD, HPCD und CD und bei pH 2,0 (i), pH 5,8 (j), pH 7,4 (k) und pH 8,0 (l).

Die Löslichkeitskurven von Nisin in SACD-Lösungen wurden bei verschiedenen pH-Werten aufgezeichnet (Abb. 3e – h). Bei pH 2,0 stieg die Absorption des Nisins linear mit steigender SACD-Konzentration. Die relative hydrophile Eigenschaft von Nisin unter pH 2,0 könnte ein Vorteil für die Bildung von Komplexen mit SACD sein, da in den komplexierenden Lösungen mehr solubilisiertes Nisin vorlag. Bei höheren pH-Werten von 5,8, 7,4 und 8,0 wurden nichtlineare angepasste Kurven für die Löslichkeit von Nisin in SACD-Lösungen beobachtet. Dieser Effekt könnte auf intermolekulare nukleophile Additionsreaktionen mit Nisin zurückzuführen sein, die die Löslichkeit von Nisin bei alkalischem pH-Wert von 34 verringerten. Glücklicherweise zeigte SACD eine zufriedenstellende Wirkung, indem es die unerwünschte Umwandlung von Nisin unter relativ alkalischen Bedingungen verhinderte und Nisin im verwendeten pH-Bereich löslich machte.

Um die Wirksamkeit von SACD bei der Erweiterung des Anwendungsbereichs von Nisin zu unterscheiden, haben wir das Komplexierungsverhalten von Nisin mit SACD und zwei häufig verwendeten CDs, β-CD und HP-β-CD, weiter verglichen (Abb. 3i – l). Sowohl β-CD als auch HP-β-CD zeigen erhebliche Verbesserungen der Löslichkeit von Nisin. Offensichtliche Rotverschiebungen für die Wellenlänge bei der maximalen Absorption wurden bei relativ alkalischen Bedingungen beobachtet (z. B. erschien die maximale Absorption von Nisin in HP-β-CD-Lösung bei 205 nm bei pH 8,0). Die Absorption von Nisin in Lösungen, die HP-β-CD enthielten, war für die vier ermittelten pH-Situationen höher als die, die β-CD enthielten. Die maximalen Absorptionswerte von Nisin in SACD-Lösungen lagen jedoch weit über dem Wert von Nisin in β-CD- oder HP-β-CD-Lösungen. Daher konnte der Schluss gezogen werden, dass SACD einige Vorteile bei der Förderung der Löslichkeit von Nisin in neutralen und alkalischen Situationen aufwies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Komplexierung von Nisin mit SACD seine Wasserdispergierbarkeit erheblich erhöhen kann, was für eine breitere Nutzung von Nisin in verschiedenen Industrien von Vorteil wäre.

Die Stabilität von Nisin-SACD-Komplexen bei verschiedenen pH-Werten wurde durch Messung des solubilisierten Nisins in Lösungen nach 0- und 10-tägiger Lagerung bewertet. Aus diesen Daten wurde der Retentionsindex (RI) berechnet und zur Angabe der Stabilität des Nisins in den verschiedenen Komplexen verwendet (Abb. 4). Alle Proben zeigten nach 10-tägiger Lagerung eine gute Stabilität mit RI-Werten über 100 %. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Komplexierung das Nisin bei allen untersuchten pH-Werten stabilisieren konnte und dass die Bildung der Komplexe möglicherweise relativ langsam verlief. Bemerkenswerterweise waren die RI-Werte des Nisins in den Komplexen mit niedrigen SACD-Konzentrationen deutlich höher als in denen mit hohen Konzentrationen. Laut einer früheren Studie gibt es in einem SACD-Molekül mehrere Esterzweige, die an Nisin binden können, wie durch FTIR-Analyse gezeigt21. Da es sich um ein Peptid mit einer relativ ungeordneten Molekülstruktur handelt, ist es für Nisin schwierig, mit relativ kleinen SACD-Molekülen vollständige Komplexe einzugehen. Nisin braucht Zeit, um sich auszudehnen und die unbesetzten Stellen auf den Oberflächen der SACD-Moleküle zu finden. Wenn mehr SACD in die Systeme einbezogen wurde, wurde ein geringerer Anstieg des RI von Nisin beobachtet. Dies kann daran liegen, dass auf dem Nisinmolekül weniger freie Stellen für die Bindung an die SACD zur Verfügung standen.

Der Retentionsindex (RI) von Nisin-SACD-Komplexen bei verschiedenen SACD-Konzentrationen (2, 4, 6, 8 und 10 mg/ml) nach 10-tägiger Aufbewahrung bei pH 2,0, 5,8, 7,4 und 8,0. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung aus drei Tests derselben Probe dar.

Die Beständigkeit der Nisin-SACD-Komplexe gegenüber Hochtemperatur-Dampfsterilisation wurde bestimmt, da die thermische Stabilität von Formulierungen für industrielle Anwendungen wichtig ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass es bei der thermischen Verarbeitung zu einem chemischen Abbau von Nisin kommt34, was seine antibakterielle Aktivität verringert3,35. Nach der Komplexierung mit SACD wurde bei keinem der untersuchten pH-Werte ein thermischer Abbau von Nisin beobachtet, und nach der thermischen Behandlung kam es zu einem deutlichen Anstieg der Menge an solubilisiertem Nisin (Abb. 5). Diese Effekte waren am ausgeprägtesten bei den Komplexen, die geringe SACD-Konzentrationen (2 mg/ml) enthielten und im Vergleich zu denen ohne Sterilisation mehr als das Doppelte an solubilisiertem Nisin aufwiesen. Der Solubilisierungseffekt machte sich bei höheren pH-Werten deutlicher bemerkbar, wobei nach der thermischen Behandlung bis zu dreimal mehr Nisin in der 2 mg/ml SACD-Lösung solubilisiert wurde. Wenn während des Komplexierungsprozesses mehr SACD-Moleküle vorhanden waren, schien die Verstärkung der Solubilisierung von Nisin durch hohe Temperaturen geringer zu sein, was daran liegen könnte, dass die Sättigung der Komplexe zwischen Nisin und SACD nur allmählich erfolgte. Dennoch wurde bei einer SACD-Konzentration von 10 mg/ml immer noch ein deutlicher Anstieg des RI-Werts für Nisin (>120 %) beobachtet. In einer früheren Studie schützte die Komplexierung von Nisin mit Gummi Arabicum und Pektin es vor thermischem Abbau bei 121 °C, die Löslichkeit von Nisin wurde jedoch nicht verbessert1,3. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Komplexierung mit SACD nicht nur die thermische Stabilität von Nisin erhöhte, sondern auch seine Solubilisierung beim Erhitzen erhöhte.

Der RI von Nisin-SACD-Komplexen mit unterschiedlichen SACD-Konzentrationen (2, 4, 6, 8 und 10 mg/ml) und pH-Werten (2,0, 5,8, 7,4 und 8,0) nach 30-minütiger Behandlung bei 121 °C. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung aus drei Tests derselben Probe dar.

Schließlich haben wir die antibakterielle Aktivität der in dieser Studie entwickelten Nisin-SACD-Komplexe gegen S. aureus bestimmt. S. aureus wird üblicherweise als grampositives Modellbakterium verwendet, um die antibakterielle Wirkung des bakteriostatischen Mittels vorherzusagen. Mittlerweile ist es eine bedeutende Ursache für lebensmittelbedingte Erkrankungen, die zu Gastroenteritis, Durchfall und Erbrechen führen36. Lebensmittel, die anfällig für eine S. aureus-Vergiftung sind, einschließlich Fleisch, Eier und Milchprodukte37. Es ist bekannt, dass Nisin Bakterien deaktivieren kann, indem es an der Zellmembran adsorbiert, die Zellmembran zerstört und den Verlust essentieller intrazellulärer Komponenten fördert38. Wie in Abb. 6a gezeigt, zeigte reines Nisin unter den verwendeten Bedingungen nur eine mäßige antibakterielle Aktivität, wobei der OD600-Wert der Bakteriensuspension von 1,23 auf 0,46 (2,7-fach) sank. Um die Zellmembranveränderung von Bakterien nach der Behandlung mit Nisin-SACD-Komplexen zu beobachten, wurde die Oberflächenmikrostruktur der behandelten Bakterien durch Sammeln von REM-Bildern beobachtet (Abb. 6b). Das Erscheinungsbild der Bakterien veränderte sich von einer Kugel in eine unregelmäßige Form, was den Bruch der Zellmembran beweist. Im Gegensatz dazu zeigten die Nisin-SACD-Komplexe eine viel stärkere antibakterielle Aktivität, wobei der OD600-Wert auf 0,04 (31-fach) sank. Im REM-Bild der Sammlung von mit Nisin-SACD-Komplexen behandelten Kulturen konnten nahezu keine zellähnlichen Strukturen beobachtet werden. Diese erhöhte antimikrobielle Aktivität kann auf die erhöhte Löslichkeit und chemische Stabilität des Nisins in den Komplexen zurückgeführt werden. Darüber hinaus könnte die erhöhte bakterizide Wirkung der Komplexe auch auf eine gewisse antibakterielle Aktivität des SACD zurückzuführen sein. SACD enthält Carboxylgruppen an seinen Oberflächen, die eine saurere Mikroumgebung um die Bakterien herum schaffen und so deren Wachstum behindern könnten27,39. In unserer vorherigen Studie zeigte reines SACD in einer relativ hohen Dosis eine antibakterielle Aktivität gegen S. aureus27. Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass die Anwesenheit von SACD die antibakterielle Wirkung von Nisin durch die Bildung von Komplexen verbesserte, die seine Löslichkeit und Aktivität erhöhten.

Die OD600-Werte der Bakterienkulturen ohne jegliche Behandlung und behandelt mit SACD, Nisin und Nisin-SACD-Komplexen (a). Die SEM-Bilder von S. aureus, gesammelt aus Kulturen der Leerproben, SACD-, Nisin- und Nisin-SACD-Komplexproben (b). Die Fluoreszenzintensität lebender/toter Bakterien in S. aureus-Kulturen, die mit Blindproben, SACD-, Nisin- und Nisin-SACD-Komplexproben behandelt wurden (c). Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung aus drei Tests derselben Probe dar.

Um die praktische Anwendung von Nisin-SACD-Komplexen zu unterstützen, wurden die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Nisin-SACD und HSS-Nisin-SACD bestimmt. Die beiden Komplexe hatten eine MHK von 20 mg/ml bzw. 40 mg/ml gegen S. aureus. Im eingestellten Konzentrationsbereich für die alleinige Verwendung von Nisin und SACD wurden jedoch keine signifikanten antibakteriellen Wirkungen beobachtet. Obwohl für HSS-Nisin-SACD eine höhere MHK beobachtet wurde, zeigt die Komplexierung mit SACD immer noch einen signifikanten Schutz und Erhalt der biologischen Aktivität von Nisin nach einer Hochtemperaturbehandlung. Nach der Behandlung der Bakterien mit Nisin-SACD oder HSS-Nisin-SACD in ihren MHK-Werten waren im Vergleich zur unbehandelten Gruppe sowohl Gesamt- als auch tote Bakterien in geringen Mengen vorhanden (Abb. 6c). Dies weist darauf hin, dass die Vermehrung von Bakterien effektiv verboten wurde. Ein gewisser Grad an Hemmung der Bakterienvermehrung wurde durch einfache Behandlung der Bakterienkultur mit Nisin oder SACD beobachtet, wie bereits gezeigt. Die Ergebnisse bestätigten erneut, dass die Komplexierung zwischen Nisin und SACD einen synergistischen Effekt aufwies und die biologische Aktivität von Nisin und SACD deutlich steigerte. Ein ähnlicher synergistischer Effekt zwischen Nisin und Carvacrol wurde von Li et al. berichtet. 40.

In dieser Studie wurde SACD verwendet, um die Löslichkeit, Stabilität und antibakterielle Aktivität von Nisin durch Bildung von Molekülkomplexen zu verbessern. Aufgrund der beträchtlichen Rotverschiebungen spezifischer Peaks, die in den FTIR-Spektren beobachtet wurden, wurden starke Wechselwirkungen zwischen den Nisin- und SACD-Molekülen abgeleitet. Die hochkristallisierte Molekülstruktur von Nisin wurde nach der Bildung der Nisin-SACD-Komplexe in eine amorphe Struktur umgewandelt. Die schwächeren molekularen Wechselwirkungen in den Komplexen als in reinem Nisin verringerten ihre allgemeine thermische Stabilität. Dennoch schien das Nisin in den Komplexen gegenüber einem Abbau bei höheren Temperaturen stabil zu bleiben. UV-sichtbare Spektroskopie deutete darauf hin, dass die Wechselwirkungen zwischen Nisin und SACD vom pH-Wert der umgebenden Lösung abhingen, wobei bei höheren pH-Werten stärkere Wechselwirkungen auftraten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Komplexierung von Nisin mit SACD seine Löslichkeit, Stabilität und Aktivität unter neutralen und alkalischen Bedingungen verbessern könnte. Darüber hinaus verbesserte die Komplexierung die Beständigkeit des Nisins gegenüber einer Sterilisation mit hohem Dampf. Schließlich wurde gezeigt, dass die antibakterielle Aktivität von Nisin-SACD- und HSS-Nisin-SACD-Komplexen gegenüber einem grampositiven Modellbakterium (S. aureus) viel wirksamer ist als reines Nisin. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Komplexierung von Nisin mit SACD ein großes Potenzial für die Verbesserung seiner Verwendung als antibakterielles Mittel in Lebensmittel- oder Arzneimittelformulierungen bietet. Zukünftig sind In-vitro- und In-vivo-Studien erforderlich, um die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Komplexe zu beurteilen. Darüber hinaus müssen noch etwaige rechtliche und skalierbare Hürden überwunden werden, bevor sie in der Praxis flächendeckend eingesetzt werden können.

Nisin aus Streptococcus lactis, β-Cyclodextrin (≥ 99,5 %, β-CD), Bernsteinsäure (SA) und Natriumhypophosphit (SHP) wurden von Aladdin Regent Co. (Shanghai, China) bezogen. Andere Chemikalien waren von analytischer Qualität. Zur Herstellung wässriger Lösungen wurde in allen Experimenten entionisiertes Wasser verwendet.

SACD wurde mit der in unserer vorherigen Studie21 beschriebenen Methode hergestellt. Kurz gesagt wurden 4,00 g β-CD, 2,96 g SA, 4,00 g SHP und 40 ml entionisiertes Wasser gemischt und gerührt, bis es vollständig gelöst war. Nach dem Gießen der gemischten Lösung auf eine runde Platte (Durchmesser 160 mm) wurde die Probe 3–5 Stunden lang in einem Ofen bei 100 °C getrocknet. Anschließend wurde die Platte in einen anderen auf 140 °C eingestellten Ofen überführt und 20 Minuten lang dort gehalten, damit die Veresterungsreaktion ablaufen konnte. Nach dem Abkühlen der veresterten Proben auf Raumtemperatur (ca. 0,5 Stunden) wurde das Rohprodukt gesammelt, indem es zunächst in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst und dann durch Zugabe eines Überschussvolumens an absolutem Ethanol ausgefällt wurde. Dieser Waschvorgang wurde noch zwei- bis dreimal wiederholt, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen im Endprodukt zurückblieben. Anschließend wurde die Probe über Nacht getrocknet, um das Ethanol zu entfernen, und das Endprodukt wurde gesammelt.

Nisin wurde mit SACD komplexiert, indem 1 mg Nisin in 10 ml SACD-Lösung (400 mg/ml) gelöst wurde. Nach gründlichem Mischen wurde die Lösung 5 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt und gefriergetrocknet, um ihn zur Festkörperbeurteilung in eine Pulverform umzuwandeln.

Der Einfluss des pH-Werts auf die Löslichkeit von Nisin in SACD-Lösungen wurde bewertet. Lösungen mit SACD-Konzentrationen von 0, 2, 4, 6, 8 und 10 mg/ml wurden durch Solubilisierung von SACD in Pufferlösung mit unterschiedlichen pH-Werten hergestellt. Die resultierenden Proben werden als freies Nisin, Nisin-SACD2, Nisin-SACD4, Nisin-SACD6, Nisin-SACD8 bzw. Nisin-SACD10 bezeichnet. Außer bei Verwendung von HCl zur Einstellung des pH-Werts auf 2,0 wurden Phosphatpufferlösungen zur Herstellung unterschiedlicher pH-Werte (5,8, 7,4 und 8,0) verwendet. Dann wurde 1 mg Nisin zu den oben genannten SACD-Lösungen mit unterschiedlichen pH-Werten hinzugefügt. Die SACD-Konzentration lag bei jedem pH-Wert zwischen 2 und 10 mg/ml. Die resultierenden Suspensionen wurden 8 Stunden lang bei 25 °C gerührt, damit das Nisin eine gesättigte Solubilisierung erreichte. Nach der Entfernung aller ungelösten Substanzen durch Passieren von Filtern mit einer Porengröße von 0,45 μm wurde die solubilisierte Menge an Nisin mit einem UV-sichtbaren Spektrophotometer (UV-1800PC, Mapada, China) bei 201 nm quantifiziert. Die Wirt-Gast-Wechselwirkungen zwischen Nisin und SACD konnten anhand der Wellenlängenverschiebungen der maximalen Absorption von Nisin nach der Komplexierung mit SACD beobachtet werden. Anschließend wurden die Löslichkeitskurven von Nisin in SACD-Lösungen bei verschiedenen pH-Werten erstellt, indem der Absorptionswert als Funktion der SACD-Konzentration aufgetragen wurde. Zusätzliche Kontrollgruppen mit Nisin im Komplex mit 10 mg/ml β-CD und 10 mg/ml HP-β-CD wurden bei pH 7,4 hergestellt, um die Wirksamkeit von Nisin-SACD zu beweisen. Die Proben werden als Nisin-CD10 bzw. Nisin-HPCD10 bezeichnet. Alle anderen zur Herstellung der Komplexlösungen verwendeten Verfahren waren die gleichen wie für die Nisin-SACD-Proben.

Infrarotspektren der pulverförmigen Proben wurden mit einem FTIR-Spektrometer (Nicolet Nexus 470, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA) bei Wellenzahlen von 400 bis 4000 cm−1 gesammelt.

Die kristalline Struktur der angetriebenen Nisin-SACD-Komplexe wurde mittels Röntgenbeugungsanalyse (XRD) unter Verwendung eines kommerziellen Instruments (D2 PHASER, Bruker, Deutschland) bei einer Betriebsspannung von 40 kV und einem Beugungswinkel (2θ) im Bereich von 4 bestimmt ° bis 40°.

Das thermische Verhalten der Nisin-SACD-Komplexe wurde mit einem thermogravimetrischen (TG) Analysesystem (TGA2, Mettler-Toledo, Schwerzenbach, Schweiz) unter N2 (50 ml/min) bei einer Heizrate von 10 °C/min über einen Temperaturbereich bewertet Bereich von 30 bis 600 °C.

Um die Auswirkungen des pH-Werts auf die Stabilität von Nisin-SACD zu bewerten, wurde die Menge an Nisin in den Komplexlösungen 10 Tage nach der Solubilisierung bestimmt. Die Lagerdauer wurde auf der Grundlage vorläufiger Experimente festgelegt, um sicherzustellen, dass der Komplexierungsprozess ein vollständiges Gleichgewicht erreicht. Die thermische Stabilität der Nisin-SACD-Komplexe wurde auch bewertet, indem sie 30 Minuten lang einer Hochdruck-Dampfsterilisationsbehandlung bei 121 °C ausgesetzt wurden. Der Anteil des in den Nisin-SACD-Komplexen solubilisierten Nisins wurde durch Messung der Absorption bei 201 nm mit einem UV-sichtbaren Spektrophotometer (UV–1800PC, Mapada, China) bestimmt. Als Kontrollgruppe wurden die gleichen Verfahren mit einer Nisinsuspension durchgeführt. Der Retention Index (RI) wurde dann anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Die antimikrobiellen Aktivitäten der Proben wurden unter Verwendung von S. aureus (ATCC 6538) als repräsentativem grampositivem Bakterium bestimmt. Die optische Dichte (OD) wurde zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität des Nisins und der Nisin-SACD-Komplexe41,42 verwendet. Die Bakterien wurden auf Luria-Bertani-Medium 24 Stunden lang bei 37 °C vorkultiviert, um Impfkulturen zu erhalten. Diese Impfkulturen wurden dann unter Verwendung von Luria-Bertani-Medium auf 106 KBE verdünnt. 1 mg Nisin, 50 mg Nisin-SACD (enthaltend 1 mg Nisin) und 50 mg SACD wurden abgewogen und getrennt in 10 ml verdünnte Bakterienkultur gegeben. Als Blindkontrollgruppe wurde eine Bakterienkultur ohne Probe verwendet. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde das Bakterienwachstum im Kulturmedium durch Aufzeichnung der OD bei 600 nm (OD600) mit einem UV-sichtbaren Spektrophotometer (UV–1800PC, Mapada, China) bestimmt.

Nach Bestätigung der antibakteriellen Aktivität von Nisin-SACD-Komplexen wurde die MHK von Nisin-SACD-Komplexen weiter mit der Bouillon-Mikroverdünnungsmethode gemessen, wie von Li et al. berichtet. 40. Die Anfangskonzentrationen von Nisin, SACD, Nisin-SACD und hochdruckdampfsterilisiertem Nisin-SACD (HSS-Nisin-SACD) wurden auf 400 µg/ml, 40 mg/ml, 40 mg/ml (enthaltend 400) eingestellt µg/ml Nisin) bzw. 40 mg/ml (enthält 400 µg/ml Nisin). Die anfänglichen Lösungen wurden dann seriell verdünnt, bis ihre Konzentration 3,125 µg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,3125 mg/ml bzw. 0,3125 mg/ml erreichte. 100 µL der Proben in unterschiedlichen Konzentrationen wurden dann mit 100 µL S. aureus-Verdünnungen, die 106 CFU-Bakterien enthielten, in 96-Well-Platten kultiviert. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Konzentration, bei der sich die OD600 nicht signifikant von der der Blindgruppe (ohne Bakterienimpfung) unterschied, wurde als MHK angesehen. Mit Nisin-SACD und HSS-Nisin-SACD am MIC behandelter S aureus wurde unter Verwendung eines Doppelfärbekits für lebende/tote Bakterien (LMAI Bio, China) weiter gefärbt, und die Anzahl der Gesamtbakterien und toten Bakterien konnte durch die Fluoreszenz dargestellt werden Intensitätswert direkt. Beachten Sie, dass es keinen statistischen Zusammenhang zwischen der Fluoreszenzintensität der gesamten Bakterien und der toten Bakterien gibt, da diese durch zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gefärbt werden.

Nach der Kultivierung mit Nisin-SACD, SACD und Nisin wurde die Morphologie der Bakterien unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (SU8100, SEM, Hitachi, Japan) sichtbar gemacht. Die Proben wurden auf Rußband aufgebracht und dann vor der Analyse mit Gold beschichtet.

Alle Messungen wurden an separaten Proben in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Ergebnisse, die numerische Werte ergaben, werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. Die ANOVA-Analyse der experimentellen Daten wurde mit der Statistiksoftware SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Unterschiede wurden mit einem Signifikanzniveau von 95 % (p < 0,05) berücksichtigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit verfügbar sind.

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20210458) unterstützt.

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Xiaojing Li

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Shangyuan Sang

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Jinpeng Wang

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Korrespondenz mit Jinpeng Wang, Zhengyu Jin oder Chao Qiu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hu, Y., Xing, K., Li, X. et al. Cyclodextrincarboxylat verbessert die Stabilität und Aktivität von Nisin in einem breiteren Spektrum von Anwendungsbedingungen. npj Sci Food 7, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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Eingegangen: 01. August 2022

Angenommen: 13. Februar 2023

Veröffentlicht: 20. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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