Die Erhöhung des intrazellulären Natriums tötet selektiv Hepatokarzinomzellen ab und induziert bei Mäusen eine Schrumpfung des hepatozellulären Karzinomtumors

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 574 (2023) Diesen Artikel zitieren

536 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Pharmakologische Behandlungen für fortgeschrittenes hepatozelluläres Karzinom (HCC) haben eine teilweise Wirksamkeit. Ein erhöhter Na+-Gehalt und Wassereinlagerungen werden bei Krebserkrankungen beim Menschen beobachtet und bieten unerforschte Angriffspunkte für Krebstherapien. Die Na+-Spiegel werden bei Behandlungen mit dem antibiotischen Kation-Ionophor Monensin durch Fluorimetrie, ICP-MS, 23Na-MRT, NMR-Relaxometrie, konfokale oder Zeitrafferanalyse im Zusammenhang mit Energieproduktion, Wasserflüssen und Zelltod bewertet, wobei sowohl murine als auch menschliche HCC-Zellen eingesetzt werden Linien, primäre Maus-Hepatozyten oder HCC-Allotransplantate in NSG-Mäusen. Der Na+-Gehalt in HCC-Zellen und -Gewebe ist 8–10 Mal höher als der von gesunden Hepatozyten und Lebern. Monensin erhöht den Na+-Spiegel in HCC-Zellen und in HCC-Allotransplantaten weiter, jedoch nicht in primären Hepatozyten und in normalem Leber- und extrahepatischem Gewebe. Der Na+-Anstieg ist mit einem Energieabbau, einer mitochondrialen Na+-Belastung und einer Hemmung des O2-Verbrauchs verbunden. Der Na+-Anstieg führt zu einer Verlängerung der intrazellulären Wasserlebensdauer und zum Absterben von HCC-Zellen sowie zu einer Rückbildung und Nekrose von Allotransplantat-Tumoren, ohne die proliferierende Aktivität von HCCs oder gesundem Gewebe zu beeinträchtigen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass HCC-Zellen im Gegensatz zu gesunden Zellen energetisch nicht in der Lage sind, eine pharmakologisch induzierte Na+-Belastung zu kompensieren und zu überleben, was die Na+-Homöostase als medikamentöses Ziel für die HCC-Therapie hervorhebt.

Das Hepatokarzinom (HCC) ist die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache1, wobei seine Inzidenz in den nächsten Jahrzehnten voraussichtlich zunehmen wird2. HCC wird häufig in mittleren und fortgeschrittenen Stadien entdeckt und die Hauptbehandlung in diesen Phasen ist eine systemische Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren2, 3. Dieser Ansatz verbessert das kurzfristige Überleben der Patienten, gewährleistet jedoch selten eine vollständige Remission und kann dazu führen wiederum schädliche Nebenwirkungen auf normales Gewebe hervorrufen2,3.

Die Suche nach alternativen Therapiemöglichkeiten, etwa der gezielten Behandlung spezifischer Merkmale von Krebszellen, ist von entscheidender Bedeutung. Es gibt nur sehr wenige krebsspezifische Merkmale. Eines, das bei den meisten Krebsarten praktisch häufig vorkommt, ist ein umgekehrter pH-Gradient mit einer intrazellulären Alkalisierung und einer damit einhergehenden extrazellulären Ansäuerung4,5. Der intrazelluläre alkalische pH-Wert beruht auf einer verstärkten Reaktion auf den Anstieg von Säurespezies, die durch die Aktivierung der Glykolyse erzeugt werden, die selbst in Gegenwart von Sauerstoff die Hauptenergiequelle in Krebszellen darstellt (Warburg-Effekt). Intrazelluläre Alkalose ist auf die erhöhte Expression und Aktivierung von pH-regulierenden Proteinen zurückzuführen, darunter die Na+-abhängigen Transporter, die einen Netto-Na+-Einstrom aus dem extrazellulären Raum in das Zytosol begünstigen4,5.

In frühen Studien mit nicht krebsartigen primären Nagetier-Hepatozyten (HPs) untersuchten wir die Rolle veränderter intrazellulärer Na+-Konzentrationen ([Na+]i) beim Tod und bei der Resistenz gegen den Tod. Wir fanden heraus, dass eine fortschreitende Na+-Belastung dem HP-Tod vorausging, der durch toxische Bedingungen verursacht wurde, die die mitochondriale Aktivität und Energieproduktion beeinträchtigten, und dass die Verhinderung eines Na+-Anstiegs das Auftreten des Zelltods verzögerte6,7. Die irreversible Veränderung der Na+-Homöostase führte zu einer Deregulierung der hepatozellulären Volumenverringerungsmechanismen und schließlich zum Tod der HPs6,7,8.

Die Bedeutung von [Na+]i-Variationen für die Lebensfähigkeit von Krebszellen ist bislang unbekannt und die verfügbaren Daten zur Na+-Homöostase bei Krebs sind begrenzt. Bahnbrechende Studien mit energiedispersiver Röntgenmikroanalyse haben jedoch einen signifikanten Anstieg des intrazellulären Na+ in Tumor-Nagetierzellen im Vergleich zu nicht krebsartigen Primärzellen berichtet9. In jüngerer Zeit bestätigte die nicht-invasive 23Na-Magnetresonanztomographie (23Na-MRT)-Analyse von menschlichen bösartigen Gliomen, Brust- und Prostatatumoren eine höhere Konzentration von Na+ im Vergleich zu den umgebenden normalen Geweben10,11,12,13. Darüber hinaus zeigten MRT-14,15 und relaxometrische Untersuchungen mit der Fast-Field-Cycling Nuclear Magnetic Resonance (NMR)16,17,18 einen Zusammenhang zwischen der erhöhten zellulären Wassermolekül-Ausflussratenkonstante (kio) und der Krebsaggressivität. Daher wurden der Anstieg des [Na+]i und des Wasserflusses durch die Zellmembran erst kürzlich als neue Krebsbiomarker angesehen, die sowohl für diagnostische als auch prognostische Zwecke wertvoll sind10,11,12,13,14,15,16,17, 18. Sie stellen außerdem zwei völlig unerforschte Angriffspunkte für die Krebstherapie dar.

Monensin ist ein von der FDA zugelassenes Antibiotikum für veterinärmedizinische Zwecke und wird häufig als wirksamer und sicherer Futterbestandteil mit kokzidiostatischer Wirkung eingesetzt. Neben seiner veterinärmedizinischen Verwendung haben zahlreiche präklinische Studien eindeutig gezeigt, dass Monensin starke krebsbekämpfende Wirkungen in extrahepatischen Tumoren und Tumorzellen aufweist19,20. Monensin induziert nachweislich Apoptose und hemmt die In-vitro-Proliferation zahlreicher Arten von Krebszellen, einschließlich solcher, die eine Mehrfachresistenz aufweisen19, und reduziert das Wachstum xenogener extrahepatischer Tumoren in vivo deutlich20,21,22,23,24.

Bisher wurde die wichtigste chemische Eigenschaft von Monensin im Zusammenhang mit seiner Krebswirkung noch nie untersucht. Monensin ist in der Tat ein Polyether-Kation-Ionophor, der in der Lage ist, Na+ reversibel zu binden und es entlang des Konzentrationsgradienten durch die Zellmembran zu transportieren19. Somit kann Monensin Na+ passiv aus dem extrazellulären Raum ([Na+]e ≃ 145 mM) in das Zytoplasma ([Na+]i ≃ 15 mM) transportieren und so einen Nettoeintritt von Na+ in die Zellen induzieren19.

Auf der Grundlage unserer früheren Beobachtungen mit primären Nagetier-HPs und der sich abzeichnenden Hinweise auf einen höheren Na+-Gehalt und osmotischen Druck in Krebsgeweben untersuchten wir in der vorliegenden Studie die Hypothese, dass Krebszellen im Gegensatz zu gesunden Zellen eine höhere intrazelluläre Na+-Konzentration aufweisen Zellen sind selektiv nicht in der Lage, eine weitere Na+-Belastung, die durch die pharmakologische Behandlung des Na+-Ionophors Monensin induziert wird, zu kompensieren und zu überleben. Zu diesem Zweck untersuchten wir den Na+-Gehalt in Hepatokarzinomzellen und HCC-Allotransplantaten und untersuchten deren Empfindlichkeit gegenüber einem durch das Na+-Ionophor induzierten erzwungenen Na+-Einstrom im Vergleich zu gesunden primären HPs und normalen Geweben.

Die Auswirkungen von Monensin auf die Zelltoxizität und auf intrazelluläre Na+-Variationen wurden in murinen (C1C7) und menschlichen (HepG2) Hepatokarzinom-Zelllinien (HCC) sowie in primären Maus-HPs untersucht. Die Behandlungen wurden in Zellen überwacht, die unter normoxischen Bedingungen inkubiert wurden, und in normalen oder modifizierten Krebs-Henseleit-Puffern (Krebs), wie sie zuvor für die Studien zur Na+-Störung und zum primären HP-Tod verwendet wurden6,7,8. Um die physiologische Relevanz zu erhöhen, wurden die Behandlungen auch in normalen und individuell modifizierten DMEM-Kulturmedien unter serumfreien Bedingungen durchgeführt.

Monensin tötete dosisabhängig C1C7- und HepG2-Zellen ab, die 20 Stunden (h) in DMEM-Medium gehalten wurden, wobei die maximale Wirkung bei einer Konzentration von 10 μM beobachtet wurde (Abb. 1a – c; ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Videos 1, 2 und 5). Die in Krebs-Puffer inkubierten HCC-Zellen zeigten eine viel frühere Empfindlichkeit gegenüber Monensin, wobei die Wirkung bereits in der zweiten Behandlungsstunde sichtbar war und durch die Zugabe der wichtigsten energiegebundenen Komponente des DMEM-Mediums, 5 mM Glucose, verzögert wurde (Abb. 1e). Dementsprechend ging dem Beginn des HCC-Zelltods eine fortschreitende Erschöpfung des intrazellulären ATP voraus, und der ATP-Verlust war in HCC-Zellen ab 15 Minuten (Min.) bei Inkubation in Krebs (Abb. 1f) und ab der 4. Stunde bei Lagerung in DMEM-Medium spürbar (Abb. 1d). Im Gegensatz zu HCC-Zellen führte die Monensin-Behandlung von HPs, die entweder in Krebs- oder DMEM-Medium inkubiert wurden, im Vergleich zu unbehandelten HPs zu keinen signifikanten Veränderungen der Lebensfähigkeit und des ATP-Gehalts (Abb. 1a, b, d – f).

a Dosisabhängige Analyse der zytotoxischen Wirkungen von 20-stündigen Behandlungen mit Monensin (M) auf C1C7-, HepG2-Zellen und Hepatozyten in DMEM ± Na+. b Auswirkungen von 20-stündigen Behandlungen mit 10 μM Monensin (M) auf die Lebensfähigkeit von C1C7-, HepG2-Zellen und Hepatozyten in DMEM ± Na+. c Repräsentative In-vivo-Zelllebendbilder des intrazellulären Na+-Anstiegs (Grün: ING) und des Auftretens von Zelltod (Violett: TO-PRO3) von C1C7-Zellen, die Monensin 10 μM in DMEM + Na+ ausgesetzt waren. Zeitrahmen 30′: T0 0′ – T1 30′ – T2 60′ – T3 90′ – T4 120′. d Die ATP-Spiegel (nmol/106 Zellen) von Hp-, C1C7- und HepG2-Zellen nach 8-stündiger Behandlung mit 10 μM Monensin (M) in DMEM ± Na+ (Spiegel bei T0: Hp = 17,5 ± 2,1; C1C7 = 19,9 ± 1,8; HepG2 18,9 ± 1,9). e Lebensfähigkeit von Hp-, C1C7- und HepG2-Zellen bei 4-stündiger Behandlung mit 10 μM Monensin (M) in Krebs ± Na+ plus oder minus Glucose (glu) 5 mM. f Intrazelluläre ATP-Spiegel von Hp-, C1C7- und HepG2-Zellen bei 90-minütiger Behandlung mit 10 μM Monensin (M) in Krebs ± Na+ plus oder minus Glukose (glu) 5 mM. Die Ergebnisse werden als % der Kontrollen ausgedrückt (n = 8 unabhängige Experimente). Symbole stellen den Durchschnitt dar, während Balken die Standardabweichung darstellen. Grüne Linien stellen das Vorhandensein von Natrium im extrazellulären Medium dar. ***P < 0,001 mit Bonferroni-Mehrfachvergleichstest mit O-Weg-Varianzanalyse (ANOVA). C1C7 + M + Na+ und HepG2 + M + Na+ unterscheiden sich deutlich von C1C7 + M + Na+ und HepG2 + M + Na+; Hepatozyten +M ± Na+ in allen Panels; und C1C7 + M + Na+ + Glu und HepG2 + M + Na+ + Glu in Panel e (außer der 2. Stunde) und f.

Die Inkubation von HCCs im Na+-freien Krebs-Puffer6,7,8 oder im individuell modifizierten Na+-freien DMEM-Medium verhinderte die Abnahme des intrazellulären ATP sowie das Auftreten von Zellschäden in Monensin-behandelten HCC-Zellen (Abb. 1a). , b, d–f; ergänzende Abbildung 1; und ergänzende Videos 3 und 4). Dies deutete darauf hin, dass die Monensin-Toxizität über einen Na+-abhängigen und krebsspezifischen Mechanismus erfolgt, der offenbar mit der Energieverfügbarkeit zusammenhängt.

Wie bei den meisten transformierten Zellen sind HCC-Zellen hauptsächlich auf aerobe Glykolyse angewiesen, um Energie zu erzeugen25. Eine funktionelle mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OxPhos) kann jedoch insbesondere unter Bedingungen mit hohem Energieverbrauch als kritische ATP-Quelle fungieren. Flussanalysen der mitochondrialen O2-Verbrauchsrate (OCR) (Abb. 2a, b) zeigten, dass eine 4-stündige Inkubation mit Monensin in DMEM den basalen und Oligomycin-empfindlichen Sauerstoffverbrauch von HCC-Zellen signifikant verringerte, nicht jedoch für HPs (Abb. 2a, B). Andererseits wurde die glykolytische Aktivität, bewertet im Hinblick auf extrazelluläre Ansäuerung (Abb. 2c) und Milchsäurefreisetzung (Abb. 2d), durch Monensin sowohl in HCC-Zellen als auch in HPs erhöht. In Abwesenheit von extrazellulärem Na+ inkubierte Zellen verhinderten die verminderte Atmungskapazität von HCC-Zellen sowie die erhöhte glykolytische Aktivität sowohl von HCC-Zellen als auch von Hepatozyten (Abb. 2a–d), was darauf hindeutet, dass ein Monensin-vermittelter Na+-Einstrom eine erhöhte glykolytische Energie förderte Produktion, sondern verringerte auch die OxPhos-ATP-Produktion in HCC-Zellen weiter.

a Sauerstoffflüsse von C1C7-Zellen und Hepatozyten (HPs), die 4 Stunden lang mit (M) oder ohne 10 μM Monensin in DMEM ± Na+ inkubiert wurden. vor (T1) und nach (T2) der Zugabe des ATP-Synthase-Inhibitors Oligomycin (n ≥ 3 unabhängige Experimente). b Sauerstoffverbrauch im Zusammenhang mit der ATP-Produktion (T1-T2) von C1C7-Zellen und Hepatozyten (HPs), die 4 Stunden lang mit oder ohne 10 μM Monensin in DMEM ± Na+ inkubiert wurden. Die Daten werden als Sauerstoffverbrauch ausgedrückt, normalisiert auf den Proteingehalt der Probe (n ≥ 3 unabhängige Experimente). c Extrazellulärer pH-Wert von C1C7-Zellen und HPs, die 4 Stunden lang mit oder ohne 10 μM Monensin in DMEM ± Na+ inkubiert wurden (n = 8 unabhängige Experimente). d Milchsäurefreisetzung von C1C7-Zellen und HPs, die 4 Stunden lang mit oder ohne 10 μM Monensin in DMEM ± Na+ inkubiert wurden (n = 8 unabhängige Experimente). Werte normalisiert auf den Proteingehalt der Probe (c, d) und ausgedrückt als % der Kontrollwerte (d). *P < 0,05, ***P < 0,001 mit ungepaartem T-Test.

Das Enzym mit dem höchsten Energieverbrauch ist die allgegenwärtige Plasmamembranpumpe Na+/K+ ATPase, die hauptsächlich für die Entfernung von Na+ aus Zellen verantwortlich ist26. Eine bis zu 20-stündige Behandlung mit Monensin hatte keinen Einfluss auf die Na+/K+-ATPase-Basalaktivität, bewertet als Fähigkeit, exogen zugesetztes ATP abzubauen (Abb. 3a), wodurch eine direkte Hemmwirkung der ATPase-Pumpe ausgeschlossen wurde. Die funktionelle Aktivität der Na+/K+-ATPase, bewertet als Rb+-Aufnahmekapazität17 im Verlauf der Monensin-Behandlung ohne exogen zugesetztes ATP, zeigte eine frühe, wenn auch nicht signifikante Verringerung der Rb+-Aufnahme (Abb. 3b), die parallel zum ATP-Abbau verlief ( Abb. 1f) und unter Na+-freien Bedingungen nicht vorhanden (Ergänzende Abb. 2). Dies deutet möglicherweise darauf hin, dass der ATP-Verbrauch zur Extrusion von Natrium durch dieselbe Na+/K+-ATPase zu einer Abnahme des intrazellulären ATP führte, was dazu führte, dass dieselbe Na+/K+-ATPase-Pumpe nicht in der Lage war, eine weitere Natriumextrusion effizient anzutreiben, was zu einem fortschreitenden und fortschreitenden Anstieg führte zytotoxische Natriumbelastung. Dies steht im Einklang mit einer entscheidenden Rolle der Blockierung oder der verringerten Na+-Extrusion durch die Na+/K+-ATPase-Pumpe bei der Monensin-Toxizität. Dementsprechend beschleunigte die Blockierung der Na+/K+-ATPase mit Ouabain das Auftreten einer Monensin-induzierten Schädigung von HCC-Zellen, wodurch primäre HPs empfindlich gegenüber den toxischen Wirkungen des Ionophors wurden, allerdings nur in Gegenwart von extrazellulärem Na+ (Abb. 3c).

a Grundaktivität der Na+/K+-ATPase in Hepatozyten (HPs), C1C7- und HEPG2-Zellen, die 1 Stunde und 20 Stunden lang Monensin 10 μM (M) in DMEM ± Na+ ausgesetzt wurden, bewertet in nmol Phosphat/min/mg Protein und ausgedrückt als % von Kontrollwerte (n = 4 unabhängige Experimente). b Funktionelle Na+/K+-ATPase-Aktivität, ausgedrückt als %-Differenz der Rubidium-Aufnahme im Vergleich zur Kontrolle für C1C7-Zellen, die in Krebs-Puffer mit 10 μM Monensin inkubiert wurden (n ≥ 2 unabhängige Experimente). c Zelllebensfähigkeit von C1C7-Zellen und HPs, inkubiert mit 10 μM Monensin (M) plus oder minus 1 mM Ouabain (Ouab) Krebs ± Na+. Die Ergebnisse werden als % des jeweiligen Kontrollwerts ausgedrückt (n = 8 unabhängige Experimente). Symbole oder Balken stellen den Durchschnitt dar, während Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. ***P < 0,001 mit ungepaartem T-Test.

Wir analysierten [Na+]i-Variationen, indem wir die Änderungen der relativen Fluoreszenz des [Na+]i-Farbstoffs ION Natrium-Green AM (ING-AM) überwachten und [Na+]i durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) quantifizierten. . Die ICP-MS-Analyse zeigte, dass unbehandelte HPs im Vergleich zu HCC-Zellen von Mäusen und Menschen einen geringeren Gehalt an Na+ (ausgedrückt als nmol Na+, normalisiert auf mg zellulärer Proteine) aufwiesen (Abb. 4a). Dies bestätigte die erhöhte intrazelluläre Natriumkonzentration in Krebszellen im Vergleich zu Primärzellen, die durch Röntgenmikroanalyse beobachtet wurde9. Die unterschiedlichen Methoden sowie die unterschiedlichen verwendeten Zellen können den zweifach geringeren Anstieg erklären, der in der früheren Studie gemeldet wurde9. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Monensin [Na+]i sowohl in menschlichen als auch in murinen HCC-Zellen weiter erhöhte, den Na+-Spiegel von HPs jedoch nicht signifikant beeinflusste (Abb. 4a). Das millimolare [Na+]i wurde unter Verwendung der experimentell ermittelten Beziehung zwischen den mg Zellproteinen pro Zellzahl und einer Schätzung des Zellvolumens extrapoliert (ergänzende Abbildung 3).

eine Na+-Aufnahme von C1C7- und HepG2-Zellen und von Hepatozyten (HPs), inkubiert mit (M) oder ohne (C) 10 μM Monensin in Krebs ± Na+ oder DMEM (Kulturmedium) + Na+ (n ≥ 3 unabhängige Experimente). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mit dem Student-t-Test. b ING-Fluoreszenz von C1C7- und HepG2-Zellen und von HPs, die mit (M) oder ohne (C) 10 μM Monensin in Krebs ± Na+ inkubiert wurden. Die Werte werden als % der jeweiligen Kontrollwerte ausgedrückt: gleicher Zelltyp (Hepatozyten, C1C7- oder HepG2-Zellen), inkubiert in Abwesenheit von Monensin zum gleichen Inkubationszeitpunkt (n = 8 unabhängige Experimente). ***P < 0,001 mit Bonferroni-Mehrfachvergleichstest mit O-Weg-Varianzanalyse (ANOVA). Symbole oder Balken stellen den Durchschnitt dar, während Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen.

Fluorimetrische und In-vivo-Bildgebungsanalysen zeigten einen Anstieg der ING-AM-Fluoreszenz, der dem Auftreten der Monensin-Toxizität vorausging (Abb. 4b und 1c, Zusatzvideos 1, 2 und 5). Mit ING-AM beladene HCC-Zellen, die gleichzeitig mit dem Red MitoTracker-Farbstoff gefärbt wurden, um gesunde polarisierte Mitochondrien hervorzuheben, zeigten, dass ING-AM bei der Monensin-Behandlung zusammen mit der MitoTracker-Fluoreszenz lokalisiert wurde (Abb. 5a, b, ergänzende Abb. 4a, b und ergänzende Abbildungen). Videos 6–9), was wahrscheinlich auf einen Anstieg des mitochondrialen Na+-Gehalts hinweist. Es kann vorhergesagt werden, dass ein Anstieg der Kationenkonzentration in der mitochondrialen Matrix eine mitochondriale Hyperpolarisation induziert. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Induktion des K+-Eintritts in die Mitochondrien das mitochondriale Potenzial erhöht27,28. Dementsprechend zeigte die JC1-Analyse, dass Monensin das mitochondriale Potenzial von HCC-Zellen erhöhte (Abb. 5b). Die Inkubation von HCC-Zellen im Na+-freien Zustand hemmte den Anstieg der intrazellulären und mitochondrialen ING-AM-Fluoreszenz, der mitochondrialen Hyperpolarisation sowie der Zellpermeabilität für den Zytotoxizitätsnachweisfarbstoff TO-PRO™−3 Iodid (Abb. 5a, b, Ergänzung). Abb. 4c, d und Zusatzvideos 3 und 4).

a Repräsentative überlagerte konfokale Bilder von intrazellulärem Na+ (Grün: ING) und lebensfähigen Mitochondrien (Rot: MitoTrack). Zellkerne wurden mit DAPI (BLU) hervorgehoben. b Mitochondriale Membranpolarisation (JC1-1 rot/grüne Fluoreszenz) von C1C7-Zellen, die 4 Stunden lang Monensin 10 μM in DMEM ± Na+ ausgesetzt waren (M) oder nicht (C) (n = 8 unabhängige Experimente).**P < 0,01, * **P < 0,001 mit ungepaartem T-Test. c, d Zelluläre Wassermolekül-Effluxratenkonstanten (kio), bestimmt an HCC-Zellen, die bis zu 45 Minuten lang 10 μM Monensin in DMEM + Na+ ausgesetzt waren (M) oder nicht (C) (Panel c, C1C7 links und HepG2 rechts). ) oder Krebs ± Na+ (C1C7-Zellen, Panel d) (c, d: n ≥ 3 unabhängige Experimente). Balken stellen den Durchschnitt dar, während Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mit dem Student-t-Test.

Als osmotisch aktives Ion treibt Na+ wahrscheinlich einen entsprechenden Wassereinstrom in die Zellen voran. Die Rolle des erhöhten intrazellulären Na+-Gehalts und die Wirkung von Monensin wurden daher in Bezug auf die Kio von Krebszellen durch NMR-relaxometrische (T1) Messungen analysiert16,17,18. HCC-Zellen zeigten im Kulturmedium einen Kio im Bereich von 6,2–11,1 s−1, der bei Monensin-Behandlung signifikant abnahm (Abb. 5c, d). Interessanterweise wurde bei der Inkubation im Na+-freien Puffer keine signifikante Kio-Abnahme beobachtet (Abb. 5d). Diese Beobachtung bestätigt die Hypothese, dass die Abnahme von Kio mit dem [Na+]i korreliert. Darüber hinaus kann die beobachtete Kio-Abnahme auf die osmotisch bedingte Zellschwellung zurückzuführen sein.

Die Anti-HCC-Aktivität von Monensin wurde durch tägliche ip-Behandlung mit 4, 8 oder 16 mg/kg/Tag ab Tag 10 nach der Allotransplantatflankenimplantation des Maustumors (HepaC1C7-Zellen) bewertet (Abb. 6a und ergänzende Abb. 5a). Monensin reduzierte die HCC-Tumorgröße ab dem 4. Behandlungstag mit signifikanten Effekten bei den Dosen 8 und 16 mg/kg/Tag (Abb. 6a und ergänzende Abb. 5a). Monensin hatte keinen Einfluss auf das Überleben, das allgemeine Wohlbefinden, das durch tägliche Überwachung beurteilt wurde, sowie auf das Körpergewicht (ergänzende Abbildung 5c) der Mäuse. Am Ende wurden die Mäuse getötet, um Zellschäden, Proliferationsaktivität und Na+-Spiegel sowohl im Tumorgewebe als auch im gesunden Gewebe zu bewerten.

a Allotransplantatwachstum von C1C7-Zellen in NSG-Mäusen, die ip mit Monensin (8 mg/kg) (MON) oder mit Vehikel (C) behandelt wurden (n = 15 Kontrolle, n = 15 mit MON behandelte Mäuse). b Gewicht der extrahierten Allotransplantattumoren am Ende (n = 15 Kontrollmäuse, n = 15 mit MON behandelte Mäuse). c Repräsentative H&E-Bilder von gesunden Geweben von Mäusen, die ip mit Monensin (8 mg/kg) oder Vehikel behandelt wurden. Vergrößerung: Maßstabsbalken = 100 μm. d Repräsentative H&E-Bilder von Tumor-Allotransplantaten von Mäusen, die ip mit Monensin (8 mg/kg) oder Vehikel behandelt wurden. Nekrotische Bereiche sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Linke Felder: Profile von Zellen, die in Rot angezeigt werden, um die Zelldichte (e) und -größe (f) zu bewerten. Vergrößerung: Maßstabsbalken = 50 oder 100 μm. e Quantifizierung der Tumorzelldichte, bewertet als Zellen/mm2 in mit Vehikel oder Monensin (8 mg/kg) behandelten Mäusen. Für jede Maus wurden 20 repräsentative Bilder verwendet (n = 4 Kontrollmäuse, n = 14 mit MON behandelte Mäuse). f Quantifizierung der Zellgröße als EQPC (Durchmesser eines Kreises gleicher Projektionsfläche der Zelle) in mit Vehikel oder Monensin (8 mg/kg) behandelten Mäusetumoren. Für jede Maus wurden 20 repräsentative Bilder verwendet (n = 4 Kontrollmäuse, n = 4 mit MON behandelte Mäuse). Hpf: Hochleistungsfeld. Symbole oder Balken stellen den Durchschnitt dar, während Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. P < 0,05, ***P < 0,001 durch ungepaarten T-Test.

Monensin verursachte weder morphologische Anzeichen einer Schädigung noch beeinflusste es das Gewicht lebenswichtiger Organe wie Leber, Lunge, Milz, Niere, Herz und Gehirn (ergänzende Abbildungen 5b und 6a sowie Abbildung 6c). Monensin veränderte die Zellmorphologie und Zellularität im Darm und im Knochenmark (BM) nicht (Abb. 7c, e und ergänzende Abb. 6b) oder verringerte die Expression des Proliferationsindex ki67 (Abb. 7c – f und ergänzende Abb. 6b). Abb. 6b). Darüber hinaus hatte Monensin keinen Einfluss auf die Hämatopoese behandelter NSG-Mäuse (Abb. 7g und ergänzende Abb. 8): Gesamtzahl der BM-Zellen, Prozentsatz an CD45+ (Leukozyten), Ter119+ (erythroide Linie), Gr1+ (myeloische Linie) und LSK (Abstammungslinie – Sca1+ c-kit+, hämatopoetischer Stamm und Vorläufer) Zellen waren in beiden Gruppen gleich. Darüber hinaus wurde die Häufigkeit der einzelnen erythroiden Vorläuferpopulationen, die die unterschiedlichen RBC-Differenzierungsstadien repräsentieren, durch das Monensin-Regime nicht beeinflusst. Darüber hinaus wirkten sich Monensin-Behandlungen nicht auf BM-Zellen von NSG-Mäusen aus, denen der Tumor nicht implantiert worden war (Ergänzende Abbildungen 7 und 8).

a Repräsentative immunhistochemische Färbung für ki67 des Tumors von Mäusen, die mit Monensin (8 mg/kg) (M) oder mit Vehikel (C) behandelt wurden. Hochauflösende Bilder: Rot umrandete Profile der einzelnen Zelle. Vergrößerung: Maßstabsbalken = 50 oder 100 μm. b Diagramme zeigen den Prozentsatz der ki67-positiven Zellen im Tumor von Mäusen, die mit Monensin oder Vehikel behandelt wurden. Für jede Maus wurden 20 repräsentative Bilder verwendet. Die Spalten stellen den Durchschnitt dar, während die Balken die Standardabweichung darstellen (n = 4 C, n = 4 M behandelte Mäuse). c Repräsentative immunhistochemische Färbung für Ki67 im Darm von Mäusen, die mit Monensin oder Vehikel behandelt wurden. Vergrößerung: Maßstabsbalken = 50 oder 100 μm. d Prozentsatz der ki67-positiven Zellen im Darm von 4 verschiedenen Mäusen, behandelt mit Monensin oder mit Vehikel. Für jede Maus wurden 20 repräsentative Bilder verwendet. Die Spalten stellen den Durchschnitt dar, während die Balken die Standardabweichung darstellen (n = 4 Kontrolle, n = 4 M behandelte Mäuse). e Repräsentative immunhistochemische Färbung für ki67 im Knochenmark von Mäusen, die mit Monensin oder Vehikel behandelt wurden. Vergrößerung: Maßstabsbalken = 50 oder 100 μm. f Prozentsatz der ki67-positiven Zellen im Knochenmark von Mäusen, die mit Monensin oder mit Vehikel behandelt wurden. Für jede Maus wurden 20 repräsentative Bilder verwendet. Die Spalten stellen den Durchschnitt dar, während die Balken die Standardabweichung darstellen (n = 4 Kontrolle, n = 4 M behandelte Mäuse). g Balkendiagramme, die die Gesamtzahl der Zellen, den Prozentsatz der CD45+-Leukozyten, der gesamten und relativen Erythrozyten-Ter119+-Vorläufer und der Gr1+-Granulozyten zeigen; der Anzahl und des Prozentsatzes von LSK im Knochenmark von NSG-Mäusen, denen ein Tumor injiziert wurde; Säulen stellen den Durchschnitt dar, während Balken die Standardabweichung darstellen; Punkte stellen einzelne Mäuse dar (n = 3 Kontrollmäuse, n = 3 M behandelte Mäuse). Statistische Tests: b, d, f ns (nicht signifikant) mit ungepaartem T-Test; g nicht signifikant mit ungepaartem nichtparametrischem Mann-Whitney-U-Test; Diagramm mit % des Reifungsstadiums der roten Blutkörperchen, nicht signifikant bei zweifacher ANOVA mit einem Sidak-Mehrfachvergleichstest.

Monensin in einer Dosierung von 8 und 16 mg/kg hemmte die HCC-Entwicklung signifikant (Abb. 6a und ergänzende Abb. 5a) und reduzierte das HCC-Gewicht (Abb. 6b) am Endpunkt der Studie. Diese Effekte korrelierten nicht mit einer Verringerung von ki67 (Abb. 7a, b), wie sie in nicht transformierten proliferativen Geweben beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu war die HCC-Hemmung durch Monensin mit einer ausgedehnten Tumorschädigung und Nekrose verbunden, wie histologische Beobachtungen zeigten (Abb. 6d) und die, wie bereits berichtet, an einer Abnahme der Zelldichte gemessen wurde (Abb. 6f)29. In Übereinstimmung mit dem durch Monensin-Behandlungen in vitro induzierten verringerten Wasserkio (Abb. 5c, d) zeigten HCC-Zellen von Allotransplantaten in mit Monensin behandelten Mäusen eine signifikante Zellschwellung im Vergleich zu denen von Vehikelkontrollen (Abb. 6e).

Die durch ICP-MS bestimmten intrazellulären Na+-Konzentrationen waren in Tumoren deutlich höher als in normalen Lebern und allen anderen untersuchten Organen (Abb. 8a). Interessanterweise zeigten mit Monensin behandelte Mäuse im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen einen erheblichen Anstieg der Na+-Konzentration im Tumorgewebe (Abb. 8a). Dieser Anstieg war nur für Tumorgewebe spezifisch, während die Na+-Konzentrationen in anderen Organen von der Monensin-Behandlung nicht beeinflusst wurden (Abb. 8a).

a Na+-Gewebegehalt, gemessen durch ICP-MS in Tumoren und Organen, die NSG-Mäusen am Ende der Behandlung mit Monensin (M, ip-Verabreichung von 8 mg/kg) oder Vehikel (C) (n ≥ 3C und n ≥ 3M behandelt) entnommen wurden Mäuse). b Ausgewählte Tumor-MRT-Bilder von Kontrollmäusen (a, b) und behandelten Mäusen (c, d), aufgenommen 16 Tage nach der Inokulation von C1C7-Zellen (T16): a, c Protonen-T2-gewichtete Bilder und ihre Fusion mit den entsprechenden 23Na-Bildern ( b, d, der Farbbalken zeigt das millimolare Gewebe [Na+] an, berechnet aus der Signalintensität der Referenzprobe). c Durchschnittliche prozentuale Veränderung, berechnet für den gesamten Tumor aus den 23Na-MRT-Bildern (siehe Text). (n = 4C und n = 3M behandelte Mäuse). Auf der x-Achse ist die Zeit (Tage) nach der Inokulation der C1C7-Zellen angegeben. Balken stellen den Durchschnitt dar, während Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (Student-t-Test).

Die mit der ICP-MS-Analyse erzielten Ergebnisse wurden durch die 23Na-MRT bestätigt, die in der Lage ist, Na+-Gewebekonzentrationen nicht-invasiv und direkt zu untersuchen. Die MRT-Scans wurden an zwei Gruppen von Mäusen durchgeführt: einer mit Monensin behandelten HCC-tumortragenden Maus (Bilder c, d von Abb. 8b) im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollgruppe (Bilder a, b von Abb. 8b). Abbildung 8C zeigt die Signalintensität von Tumoren (ausgedrückt als durchschnittliche prozentuale Änderung) in der mit Monensin behandelten Gruppe und den Kontrollmäusen, die einen zwar nicht signifikanten, aber steigenden Trend zeigen. Unter Verwendung von Standardröhrchen, die Agar enthielten, eingebettet in eine 75 mM NaCl-Lösung (Abb. 8b), war es möglich, die Na+-Gewebekonzentration innerhalb des Tumors zu extrapolieren, die mit ICP-MS-Messungen korrelierte, die postmortal an denselben Tumorgeweben durchgeführt wurden (Ergänzungstabelle). 1). Darüber hinaus wurde das Tumorgewebe [Na+] jeder Maus, das während der 5 Tage der Monensin-Behandlung gemessen wurde, in der ergänzenden Abbildung 9 angegeben. Während der Behandlung beobachteten wir einen fortschreitenden Anstieg der hyperintensiven Regionen (ergänzende Abbildung 10), der wahrscheinlich entsprach nekrotisches Tumorgewebe.

Diese Studie untersuchte die Na+-Homöostase als neues Ziel zur Hemmung von HCC. Wir haben gezeigt, dass HCC-Zellen und Allotransplantate im Vergleich zu gesunden Zellen und Geweben einen erhöhten Na+-Gehalt aufweisen und dass die Behandlung mit dem Na+-Ionophor Monensin diese Werte weiter erhöht, ohne die Na+-Gehalte gesunder Gewebe zu beeinträchtigen. Wir fanden heraus, dass ein krebsselektiver Na+-Anstieg mit der Abtötung von HCC-Zellen und einer langsameren Wachstumsrate von HCC-Xenotransplantattumoren korreliert. Hier berichten wir zum ersten Mal über die Charakterisierung der an diesem Prozess beteiligten zellulären Ereignisse. Unsere Ergebnisse zeigen, dass: (i) HCC-Zellen im Gegensatz zu gesunden Hepatozyten besonders empfindlich auf die toxische Wirkung des Na+-Ionophors reagieren und energetisch nicht in der Lage sind, die pharmakologisch induzierte Na+-Belastung zu kompensieren und zu überleben; (ii) der energetische Mangel an HCC-Zellen war mit Na+-abhängigen Veränderungen der mitochondrialen Atmungskapazität verbunden. Mehrere Beobachtungen stützen diese Annahmen.

Wir fanden heraus, dass die Verhinderung eines intrazellulären Na+-Anstiegs durch den Einsatz natriumfreier Zellinkubationsmedien den Monensin-induzierten HCC-Zelltod verhinderte, was eine Natriumabhängigkeit der krebsspezifischen zytotoxischen Wirkung des Ionophors verdeutlicht. Wir beobachteten die schützende Wirkung der Na+-freien Medien, indem wir sowohl einen Salzpuffer (z. B. Krebs Henseleit) verwendeten, der zuvor in unserer frühen Studie über die Rolle intrazellulärer Na+-Veränderungen bei den endgültigen Mechanismen des primären Hepatozytentods nach ATP-Depletion verwendet wurde6,7, 8 und ein individuell modifiziertes natriumfreies DMEM-Kulturmedium, das speziell für die vorliegende Studie hergestellt wurde. Diese Versuchsbedingungen verhinderten die toxischen Wirkungen von Monensin, ohne den intrazellulären pH-Wert6 zu verändern. Monensin gilt allgemein als Natriumionophor, kann aber möglicherweise auch verschiedene Kationen durch die Membran bewegen19,20. Die Natriumkonzentration im extrazellulären Medium ist jedoch weitaus höher als die aller anderen Kationen, sodass Natrium wahrscheinlich die Kationentransportaktivität von Monensin sättigt, da die relative Konzentration von extrazellulärem Natrium 145 mM und die von verabreichtem Monensin 10 μM beträgt . Alle unter natriumfreien Bedingungen durchgeführten Experimente zeigten eine „Verhinderung“ der durch Monensin induzierten Zellveränderungen und Zytotoxizität. Zusammengenommen deuten sie darauf hin, dass die beobachteten toxischen Wirkungen von Monensin natriumabhängig waren und somit in direktem Zusammenhang mit der Fähigkeit von Monensin standen, Natrium gezielt in die Zellen zu transportieren.

Monensin hatte keinen Einfluss auf den ATP-Spiegel und die Lebensfähigkeit primärer HPs. Im Gegensatz dazu ging der Abtötung von HCC-Zellen durch Monensin ein fortschreitender ATP-Verlust und die Verhinderung eines Natriumanstiegs durch Zellen voraus, die in Abwesenheit von extrazellulärem Na+ inkubiert wurden, was zu einem Energieabbau und dem Auftreten von Zelltod führte. Monensin hemmte die basale Na+/K+-ATPase nicht direkt, aber die pharmakologische Blockierung der Na+/K+-Pumpe hob die HPs-Resistenz gegen Monensin auf und verstärkte seine zytotoxischen Wirkungen auf HCC-Zellen. Dies legt nahe, dass die Empfindlichkeit von HCC-Zellen gegenüber Monensin mit ihrer energetischen Unfähigkeit zusammenhängt, die Na+-Homöostase durch effiziente Förderung der Na+-Extrusion aufrechtzuerhalten.

Die ATP-Produktion in HCC-Zellen beruht hauptsächlich auf der anaeroben Glykolyse25. Wir haben gezeigt, dass Monensin die glykolytische Aktivität sowohl in HCC-Zellen als auch in HPs steigert. Ein solcher Effekt war natriumabhängig und daher wahrscheinlich eine Reaktion auf den erhöhten Energiebedarf, um den Überschuss an [Na+]i auszustoßen. Der erhöhte Anstieg der Säurespezies infolge der glykolytischen Aktivierung würde wiederum den Na+-Einstrom durch die Na+-abhängigen pH-Puffersysteme4,5 weiter fördern und so zur Na+-Belastung beitragen.

Die meisten Krebszellen verfügen über funktionsfähige Mitochondrien30 und können oxidative Phosphorylierung (OxPhos) nutzen, um die ATP-Produktion aufrechtzuerhalten. Wir haben gezeigt, dass Monensin den mitochondrialen Na+-Gehalt erhöht und durch einen Na+-abhängigen Mechanismus sowohl die intakte als auch die ATP-verknüpfte Atmung in HCC-Zellen verringert, nicht jedoch in HPs. Die molekularen Mechanismen solcher Na+-induzierten Störungen sind derzeit unbekannt. Frühere elektronenmikroskopische Analysen der Mitochondrien von L929-Fibroblasten, die Monensin ausgesetzt waren, zeigten jedoch das Auftreten struktureller Veränderungen wie unorganisierte und erweiterte intrakristalline Räume31. Darüber hinaus zeigte die elegante Charakterisierung der Antikrebsaktivität von Gboxin kürzlich, dass es eine wichtige pathogene Rolle spielt, da es sich in Mitochondrien als positiv geladenes Molekül ansammelt29. Diese Beobachtungen deuten auf eine Tendenz der Mitochondrien hin, als intrazelluläre Kationensenke zu fungieren. Eine solche Tendenz kann bei Überlastung (z. B. durch eine erzwungene intrazelluläre Na+-Last) die Ursache für funktionelle und strukturelle mitochondriale Dysfunktionen und den Verlust der mitochondrialen ATP-Produktion sein. Insgesamt legen diese Beobachtungen nahe, dass das konstitutiv hohe [Na+]i, erhöht durch den kontinuierlichen Na+-Zustrom, der durch Monensin und durch den glykolytischen Metabolismus induziert wird, zu einer Hemmung der mitochondrialen Atmung führt. Dadurch entsteht ein Teufelskreis aus erhöhtem Energieverbrauch und irreversiblem energetischen Stress, der dazu führt, dass HCC-Zellen im Gegensatz zu gesunden HPs nicht in der Lage sind, ein lebensverträgliches Niveau an intrazellulärem Na+ aufrechtzuerhalten.

Unsere frühen Untersuchungen mit primären HPs6,7,8 zeigten, dass bei Energiemangel ein Na+-abhängiges Ungleichgewicht des intrazellulären osmotischen Drucks für den Verlust der Plasmamembranintegrität und den HP-Tod verantwortlich war. Wir konnten diese Ereignisse nun abbilden und analysieren und zeigen, dass Monensin [Na+]i vor dem Auftreten des HCC-Zelltods zunehmend erhöht, und einen Na+-abhängigen Anstieg der intrazellulären Wasserretention nachweisen. Dementsprechend zeigten wir in vivo erhöhte Zellgrößen in HCC-Allotransplantaten von Monensin-behandelten Mäusen und mittels 23Na-MRT den Zusammenhang zwischen der intratumoralen Na+-Akkumulation und dem Auftreten hyperintensiver Signale, die wahrscheinlich nekrotischen Bereichen entsprechen.

Ein entscheidender Punkt bei der Krebstherapie ist die Minimierung/Vermeidung ihrer schädlichen Auswirkungen auf normales Gewebe. Wir haben gezeigt, dass Monensin seine zytotoxische Wirkung speziell auf transformierte Zellen und Tumore entfaltet, ohne das allgemeine Wohlbefinden der Mäuse und die Integrität lebenswichtiger Organe zu beeinträchtigen und ohne eine zytostatische Wirkung in normalen oder transformierten Geweben zu zeigen. Wichtig ist, dass wir den Mangel an antiproliferativer Aktivität von Monensin auf Darmschleimhaut und BM beobachteten, die oft empfindlich auf die meisten Krebsmedikamente reagieren. Durch eine genaue Auswertung des Hämatopoeseprozesses haben wir auch gezeigt, dass Monensin keine Auswirkungen auf die Zellularität und die Differenzierungsstadien von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläufern, einschließlich aller erythropoetischen Zelllinien, hat.

Das Fehlen einer antiproliferativen Wirkung von Monensin in unseren Modellen für allogenes HCC war nicht zu erwarten, da frühere Untersuchungen zur krebshemmenden Wirkung von Monensin über die Hemmung von Signalwegen im Zusammenhang mit der Zellproliferation berichteten20,21,22,23,24. Die krebshemmende Wirkung von Monensin wurde jedoch noch nie zuvor in Lebertumorzelllinien untersucht. Darüber hinaus unterscheiden sich unsere experimentellen Einstellungen von früheren Berichten. Tatsächlich haben wir Monensin-Behandlungen unter serumfreien Bedingungen durchgeführt, um die In-vivo-Umgebung zu reproduzieren, in der Zellen eines soliden Tumors möglicherweise nur begrenzten oder keinen direkten Kontakt mit Serumprotein haben32.

In dieser Studie verwendeten wir NGS-Mäuse, um die direkte Wirkung von Monensin auf Tumorzellen ohne gleichzeitige krebshemmende Reaktionen oder entzündliche Immunreaktionen klar zu untersuchen. In der zukünftigen Forschung wird es von entscheidender Bedeutung sein, immunkompetente Modelle einzusetzen, um gleichzeitig die Auswirkungen von Na+-Ionophoren auf die Immunentzündung zu untersuchen.

Der hohe intrazelluläre Na+-Gehalt ist mit einem alkalischen intrazellulären pH-Wert und einem umgekehrten pH-Gradienten verbunden, Bedingungen, die bekanntermaßen die Proliferation, Migration und Invasion von Krebszellen begünstigen1,2. Wir zeigen, dass diese Zustände, die allgemein als vorteilhaft für Krebszellen angesehen werden1,2, zu einem spezifischen Zustand der Krebsschwäche werden können, wenn sie durch Na+-Ionophor-Medikamente verschlimmert werden, was die Na+-Homöostase als neues Ziel für die HCC-Therapie hervorhebt. Die Na+-Homöostase wird sowohl in normalen Zellen als auch in Krebszellen durch allgegenwärtige Systeme reguliert (z. B. Na+/K+-ATPase oder Na+-abhängige pH-Puffertransporter), deren wichtigste physiologische Rolle in gesunden Geweben ihre Manipulation in Kliniken potenziell problematisch macht. Unsere In-vivo-Daten zeigen, dass die Behandlung mit dem Antibiotikum Monensin eine sichere Alternative zur Störung der Na+-Homöostase in HCC-Zellen ist, ohne normales Gewebe zu beeinträchtigen.

Die starke krebshemmende Wirkung von Kationenionophoren ist gut belegt. Im Jahr 2009 war von 16.000 untersuchten Verbindungen nur das Monensin-Analogon Salinomycin in der Lage, menschliche Krebsstammzellen mit einer 100-fach höheren Effizienz abzutöten als das häufig verwendete Chemotherapeutikum Paclitaxel33. Kürzlich identifizierte ein High-Content-Screening Monensin unter 2640 getesteten Verbindungen als die stärkste zytotoxische Verbindung. auf epithelial-mesenchymalen Übergangszellen34. Überraschenderweise wurde Monensin angesichts seiner starken Antikrebsaktivität und der zunehmenden Zahl präklinischer „In-vitro“- und „In-vivo“-Studien noch nie für translationale Studien am Menschen untersucht. Der mögliche Einsatz von Monensin in der Klinik wurde bisher nicht diskutiert, da drei Fälle von Toxizität beim Menschen nach versehentlicher Einnahme von Monensin gemeldet wurden35,36 und aufgrund der hohen Variabilität der toxischen Wirkungen bei verschiedenen Arten37.

In dieser Studie liefern wir zum ersten Mal den Proof of Concept einer krebsselektiven zytotoxischen Wirkung von Monensin, indem wir die Fähigkeit des Ionophors zeigen, den Natriumgehalt nicht nur in HCC-Zellen, sondern auch in HCC-Allotransplantaten gezielt zu erhöhen, was die Empfindlichkeit hervorhebt von HCC-Zellen auf diese pharmakologisch induzierte Na+-Belastung. Diese wichtigen Beobachtungen unterstreichen die Notwendigkeit, eine tiefergehende Analyse von Kationenionophoren voranzutreiben, sowohl neuer als auch bereits entwickelter Monensin-Analoga38, mit dem Ziel, niedrigere wirksame Dosen für ihren sicheren Einsatz als neuartige Therapeutika gegen HCC und möglicherweise gegen Krebs im Allgemeinen zu untersuchen.

Kollagenase (Typ I), N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N′-(2-ethansulfonsäure) (HEPES), fötales Rinderserum (FBS), Gentamycin (G), Penicillin (P), Streptomycin (S) , Glutamin (Gln), Na+ Pyruvat (Na+ Pyr), Oligomycin, FCCP, Rotenon, Antimycin, Ouabain, Monensin, Trypanblau, Propidiumiodid, (2-Hydroxypropyl)-b-cyclodextrin (HPCD) und alle Chemikalien für Puffer und Reagenzzubereitungen wurden von Sigma-Aldrich (Mailand, Italien) gekauft.

Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), Pierce BCA Protein Assay Kit, To-PROTTM 3-Iodid und MitoTracker Red CMXRos stammten von Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium-Kulturmedium (DMEM) und individuell modifiziertes Na+-freies DMEM (DMEM-Na+) ohne Na+-Komponenten wurden von GIBCO (SIAL-Gruppe, Rom, Italien) bezogen.

Ion Natrium Green- und Laktat-Assay-Kits wurden von Abcam (Cambridge, UK) bezogen.

JC-1 stammte von Adipogen Life Sciences (Liestal, Schweiz).

Der Pierce BCA-Proteintest und Tests für ATP (CellTiter) und Zytotoxizitätsnachweis (CelltOX) stammten von Promega (Madison, Wisconsin, USA).

Gd-HPDO3A (Prohance) wurde freundlicherweise von Bracco Imaging SpA, Bracco Research Centre, (Colleretto Giacosa, TO, Italien) zur Verfügung gestellt.

Hepatozyten (HP) wurden durch Leberperfusion von Mäusen mit Kollagenase und anschließender Differentialzentrifugation bei 50 g für 5 Minuten und 4 °C isoliert, wie bereits berichtet37. Hepatozytensuspensionen wurden dann auf mit Kollagen beschichteten Kulturschalen ausplattiert und zuvor 24 Stunden lang in DMEM (ohne Glutamin), das 10 % FBS, 100 U/ml P, 6 mM Glutamin (Gln) und 100 μg/ml S enthielt, kultiviert zu Behandlungen.

Murine Hepa1c1c7 (C1C7)-Hepatomzellen wurden von ECACC (Salisbury, UK) und menschliche HepG2-Zellen von ATCC (Manassas, VA, USA) geliefert. Sie wurden routinemäßig in DMEM ohne Glutamin, ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/ml P, 6 mM Gln, 100 μg/ml S, und EMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/ml P mit 100 μg, kultiviert /ml S bzw. 1 mM Na+ Pyruvat (Na+ Pyr). Die Zellen wurden in einer befeuchteten Kammer mit 5 % CO2/95 % Luft bei 37 °C gehalten und alle 1 bis 3 Tage geteilt. Alle Zellen wurden mit dem MycoAlert™ Mycoplasma Detection Kit negativ auf Mykoplasmen getestet. Alle Materialien wurden von Lonza (Basel, Schweiz) gekauft.

Die HPs-, C1C7- oder HepG2-Zellen wurden in sauerstoffhaltigen Krebs-Henseleit-Puffer mit normaler Natriumkonzentration (145 mM) (Krebs + Na+) oder ohne Natriumbestandteile (Krebs − Na+) mit einem Gehalt von 20 nmol suspendiert (Zelldichte 106/ml). /L HEPES (pH 7,4) und bei 37 °C unter Flussmittel mit einem 95 % O2/5 % CO2-Gasgemisch inkubiert, gemäß unseren früheren Studien an primären Nagetier-Hepatozyten6,7,8. Sowohl im Na+-freien Krebs als auch im Na+-freien DMEM wird Natrium durch Cholin ersetzt, um die normale Osmolarität des Mediums aufrechtzuerhalten. Bei Bedarf wurden die Zellen mit Monensin (10 μM) behandelt oder 15 Minuten mit Glucose (5 mM) oder Ouabain (1 mM) vorinkubiert.

Alternativ wurden HPs-, C1C7- oder HepG2-Zellen in Abwesenheit von Serum in DMEM mit hohem Glucosegehalt (5 mM) und normalem Natriumgehalt (145 mM) DMEM (+ Na+) oder ohne jegliche Natriumkomponente DMEM (-Na+) suspendiert ( GIBCO, SIAL, Rom, Italien). Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 106/ml oder in vierfacher Ausführung in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (5000 Zellen/Vertiefung) in Gegenwart oder Abwesenheit von Monensin (0,5, 1, 2,5, 5, 7,5 oder 10 μM) ausgesät. DMEM (-Na+) wurde von der SIAL-Gruppe hergestellt, indem es die Änderungen der Salzzusammensetzung von Krebs (-Na+)6,7,8 widerspiegelte und alle anderen DMEM-Komponenten unverändert ließ.

Die Lebensfähigkeit der Zellen und das intrazelluläre ATP wurden unter Verwendung der Protokolle CellTox und Cell-Titer (Promega; Madison, Wisconsin, USA) bestimmt. Die ATP-Werte wurden unter Ausschluss des von toten Zellen freigesetzten ATP korrigiert, wie durch gleichzeitige CellTox- und Cell-Titer-Analysen für jede Probe bestimmt. Kurz gesagt, zu den angegebenen Behandlungszeitpunkten wurden 50 µl Zellen (5000 Zellen/Well in einem 96-Well-Format) entnommen und auf eine undurchsichtige Testplatte gegeben, wenn sie in Suspension waren, oder direkt verarbeitet, wenn sie bereits ausgesät waren. Anschließend wurde in jede Vertiefung ein Volumen von 20 µl CellTox-Reagenz gegeben und die Fluoreszenz bei einer Anregung von 485 nm und einer Emission von 520 nm gemessen. Anschließend wurden insgesamt 100 μl/Well CellTiter-Reagenz zu der Platte mit CellTox™ Green Dye und den experimentell behandelten Zellen gegeben, woraufhin die Lumineszenz gemessen wurde.

Die basale Na+/K+-ATPase-Aktivität und die extrazelluläre Laktatfreisetzung wurden jeweils mit den Assay-Kits MyBiosource (San Diego, Kalifornien, USA) und Abcam (Cambridge, UK) gemäß den Herstelleranweisungen gemessen. Um die Na+/K+-ATPase-Aktivität zu bewerten, wurden insgesamt 2 × 106 Zellen zu 400 µl eiskaltem ATPase-Assay-Puffer gegeben und 30 Minuten bei 25 °C inkubiert, bevor die optische Dichte bei 650 nm gemessen wurde. Lebensfähigkeit, intrazelluläres ATP, Na+/K+-ATPase-Aktivität und Laktatfreisetzung wurden als % einer gleichen Menge an Proteinen (Pierce BCA Protein Assay, Waltham, Massachusetts, USA) entsprechend den mit Vehikel behandelten Proben ausgedrückt.

Die Zellatmung wurde durch hochauflösende Respirometrie unter Verwendung des Substrat-, Entkoppler-, Inhibitor- und Titrationsprotokolls (SUIT) bestimmt, wie zuvor beschrieben38. Die C1C7-Zellen wurden 4 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μM Monensin in DMEM (+ Na+) oder in DMEM (-Na+) inkubiert. Am Ende der Behandlungen wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Die pH-Werte der Überstände wurden sofort mit einem HQ440D ACH pH-Meter (Lainate, Michigan, Italien) bewertet, das mit einer Mikroelektrode ausgestattet war. Die Pellets wurden im mitochondrialen Atmungsmedium MiR05 (0,5 mM EGTA, 3,0 mM MgCl2·6H2O, 60 mM Kaliumlactobionat, 20 mM Taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM Saccharose, 1 g/L Rinderserumalbumin, pH 7,1) resuspendiert ) und auf ein hochauflösendes Oxygraph-2 K-Respirometer (Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich) übertragen. Kontroll- und behandelte Proben wurden gleichzeitig bewertet. Nach einer anfänglichen Stabilisierung des O2-Flusses wurde Pyruvat (5 mM) verwendet, um die TCA-gebundene Atmung aufrechtzuerhalten. Der ATP-Synthetase-Inhibitor Oligomycin (O) wurde in einer Endkonzentration von 5 nM zugegeben und der Sauerstoffverbrauch wurde quantifiziert, um die Oligomycin-empfindliche und -unempfindliche Atmung zu bestimmen. Die Sauerstoffverbrauchsraten wurden mit der zugehörigen Software (DatLab7, Oroboros) berechnet. Die O2-Verbrauchsraten (Fluss) wurden auf das Gesamtprotein normalisiert.

Primäre Maus-HPs, C1C7- oder HepG2-Zellen wurden mit dem intrazellulären Na+-Fluoreszenzfarbstoff ION NaTRIUM Green-AM (5 µM) in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit BSA (2 %), Pluronsäure (10 µM) und Glucose beladen ( 10 mM) für 1 h bei RT. Intrazelluläre Na+-Variationen nach der Monensin-Behandlung wurden routinemäßig mit einem Kontron SFM25-Spektrofluorometer überwacht, das auf eine Anregungswellenlänge von 525 nm und eine Emissionswellenlänge von 545 nm eingestellt war, und als % der Kontrollwerte ausgedrückt.

Die C1C7-Zellen wurden mit 3 × 104 Zellen/Well in einer 48-Well-Platte für 24 Stunden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ausplattiert. Für die Behandlungen wurden die Zellen mit frischem DMEM mit oder ohne Na+ gewaschen und dann 4 Stunden lang 10 µM Monensin oder DMSO in DMEM (+ Na+) oder in DMEM (-Na+) in Abwesenheit von FBS ausgesetzt. Nach der Behandlung wurden die Zellen in Gegenwart von 10 µg/ml JC-1, das dem Kulturmedium zugesetzt wurde, 15 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (EVOS™ XL Core Imaging System, Thermo Fisher Scientific) aufgenommen und mit der ImageJ-Software v 1.53e analysiert, wobei das Rot/Grün-Fluoreszenzverhältnis berechnet wurde (Fluoreszenz: gemessen bei einer Absorption von 490/525 nm und 540). /525 nm).

Die C1C7-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte für 24 Stunden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ausgesät und dann mit dem intrazellulären Na+-Fluoreszenzfarbstoff ION NaTRIUM Green-AM beladen. Nach dem Waschen mit DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, wurden die Zellen mit Monensin (10 µM) in Gegenwart des zellimpermeanten TO-PRO™-3-Iodidfarbstoffs (1 µM) behandelt, um Kerne toter Zellen selektiv anzufärben. Die Zellen wurden in kontrollierter Atmosphäre (5 % CO2; 37 °C) 20 Stunden lang in DMEM (+ Na+) oder in DMEM (-Na+) im Käfiginkubator des THUNDER Imager 3D Live Cell (Leica Microsystems; Deutschland) inkubiert. Die intrazellulären Na+-Variationen und das Auftreten von Zelltod wurden alle 30 Minuten mithilfe eines halbautomatischen Aufzeichnungs-/Analyseprotokolls der Live-Cell-Imager-Plattform Thunder aufgezeichnet. Negativkontrollen wurden mit Proben durchgeführt, die mit den einzelnen Farbstoffen oder ohne Farbstoffe beladen waren. Fluoreszenzänderungen wurden mit der ImageJ-Software Version 1.53e analysiert.

Die Visualisierung des Natriums und des TO-PRO-3-Farbstoffs in den C1C7-Zellen in einer Monoschichtkultur wurde mit einem Weitfeldmikroskop (Leica DMI8, Thunder 3D Live Cell Imaging System) erreicht, das mit einer Spectra X-Lichtmaschine oder einem LED8-Multifunktionsgerät ausgestattet war. LED-Lichtquelle (Leica Microsystems; Deutschland) und eine 4,2 MP DFC9000GT sCMOS-Kamera (Leica Microsystems; Deutschland). Hellfeld- und Fluoreszenz-Mehrkanalbilder wurden mit einem 20X-Objektiv (N PLAN L 20x/0,35 DR; Leica Microsystems, Deutschland) aufgenommen.

Zur Visualisierung der Fluoreszenzsonden wurden verschiedene Kombinationen aus LED-Anregungslicht und fluoreszierenden Filterwürfeln verwendet: TO-PRO-3 (640 nm Anregung, DFT51011-Filtersatz), ION NaTRIUM Green-AM (500/20 nm Anregung, YFP-Filterwürfel). Für alle quantifizierten Bilder wurden identische Parameter angewendet. Alle Daten wurden bis zur weiteren Verarbeitung als LIF-Dateien gespeichert.

Die C1C7-Zellen wurden 24 Stunden lang auf Deckgläsern ausgesät und dann wie zuvor beschrieben mit dem intrazellulären Na+-Fluoreszenzfarbstoff ION NaTRIUM Green-AM beladen. Nach einem Waschen mit 1X PBS wurden die Deckgläser mit den anhaftenden Zellen 4 Stunden lang in DMEM mit oder ohne Na+ Monensin (5 µM) gelegt. Nach Ende der Behandlung wurden die Zellen mit 100 nM des mitochondrialen Potential-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs MitoTracker Red angefärbt [45 min, kontrollierte Atmosphäre (5 % CO2; 37 °C)]. Anschließend wurden die Zellen mit 0,5 mg/ml des Fluoreszenzfarbstoffs 4,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI, Sigma-Aldrich) 5 Minuten lang bei RT angefärbt, um die Zellkerne hervorzuheben. Die Zellen wurden dann mit 1X PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Negativkontrollen wurden mit Proben ohne Farbstoffe durchgeführt. Die sequentielle Bildaufnahme erfolgte im unidirektionalen Modus mit einem konfokalen Mikroskopsystem Leica SP8 (Leica Microsystems; Deutschland). Das DAPI wurde mit einem 405-nm-Laser angeregt und die Emission von 410 bis 509 nm gesammelt; ING wurde mit einem 514-nm-Laser angeregt und die Emission von 519 bis 589 nm gesammelt; Mitotracker wurde mit einem 633-nm-Laser angeregt und die Emission von 638 bis 776 gesammelt nm. Die Bilder wurden mit einem Leica HC PL APO CS2 63×/1,40 OIL-Objektiv bei 999,66 Milliabsorptionseinheiten (mAU) aufgenommen.

Die Proben wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica SP8 abgebildet, das mit einem Argon-Laser und einem Leica HC PL APO CS2 63×/1,40 OIL-Objektiv ausgestattet war. Die Lochgröße wurde auf 1 AE eingestellt. Die Proben wurden mit 405-, 514- und 633-nm-Lasern bei 0,75, 1,50 bzw. 3,0 mW beleuchtet. 1024 × 1024 Pixel große Bilder wurden bei 600 Hz (Scangeschwindigkeit) mit HyDs- und PMTs-Detektoren aufgenommen. Die DAPI-Erfassungsparameter waren: 410–509 nm (Emissionswellenlängen-Sammelbereich), 0 (Verstärkung) und 0 (Offset). Die Erfassungsparameter für ION NaTRIUM Green-AM waren: 519–589 nm (Emissionswellenlängen-Sammelbereich), 0 (Verstärkung) und 0 (Offset), MitoTracker Red-Erfassungsparameter waren: 638–776 nm (Emissionswellenlängen-Sammelbereich), 0 (Verstärkung). ) und 0 (Offset). Auf alle Kanäle wurde ein Liniendurchschnitt von 1 angewendet. Alle Daten wurden bis zur weiteren Verarbeitung als LIF-Dateien gespeichert.

Die Bestimmung von Kio wurde wie zuvor von Ruggiero et al.16,17,18 beschrieben durchgeführt. Die C1C7- und HepG2-Zellen wurden in einem 175-cm2-Kolben mit einer Dichte von 10–12 × 106 Zellen/Kolben ausgesät. Die Zellen wurden mit 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA abgelöst.

Das gewonnene Pellet wurde im Krebs-Puffer oder im Krebs-Puffer ohne Na+ oder im Kulturmedium in Gegenwart des Vehikels (DMSO) oder 10 µM Monensin (Kontrolle bzw. behandelte Probe) resuspendiert. Im Falle einer Resuspension in Puffer wurde zuvor ein Waschschritt im gleichen Puffer durchgeführt. Während der Behandlungsdauer (15, 30 oder 45 Minuten) wurden die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten.

Nach der Behandlung wurden die Zellen zentrifugiert und in 1 ml der vorherigen Lösung, zu der 10 mM Gd-HPDO3A (Prohance) hinzugefügt wurden, resuspendiert. Die relaxometrischen Messungen wurden innerhalb von 15 Minuten durchgeführt, wobei Zellsuspensionen in 5-mm-NMR-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 0,1 rcf (4 °C) zentrifugiert wurden. Das Wasserprotonen-T1 der Zellpellets wurde bei 0,5 T und 25 °C auf einem Stelar SPINMASTER-Spektrometer (Stelar, Mede, PV, Italien) unter Verwendung der Inversion-Recovery (IR)-Pulssequenz mit 32 τ-Inkrementen (logarithmisch verteilt im 0,01) gemessen –4 s Bereich) und 2 Scans. Es wurde eine biexponentielle Erholung der Magnetisierung beobachtet. Der Kio wurde durch Analyse der IR-Daten im Hinblick auf das 2SX-Modell [14–16, 18) unter Verwendung der im folgenden Absatz beschriebenen Gleichung bestimmt.

In einer Zellsuspension verteilen sich Wassermoleküle im extrazellulären (Ex-)Raum und im intrazellulären (In-)Zytoplasma und tauschen zwischen den beiden Kompartimenten mit einer Wasseraustauschrate aus, deren Effluxrate konstant kio (=τin−1, die durchschnittliche intrazelluläre Verweilzeit) ist reziprok) bzw. Zustromratenkonstante koi (=τex−1, die durchschnittliche extrazelluläre Verweilzeit reziprok). Diese Parameter hängen durch die Gleichgewichtsmassenbilanz kio ∙ Vi= koi∙Vex zusammen, wobei Vin und Vex (=1−Vin) die intrazellulären bzw. extrazellulären Wassermolanteile sind.

Aus relaxometrischer Sicht ist jede Umgebung durch ihre eigene longitudinale Protonenrelaxationsratenkonstante, die longitudinale extrazelluläre (R1ex) und intrazelluläre (R1in) Relaxationsratenkonstante gekennzeichnet.

Die Zugabe einer ausreichenden Konzentration des extrazellulären Kontrastmittels (CA) Gd-HPDO3A zur Zellsuspension ermöglichte die Bedingung kio + koi ~ |R1ex-R1in| zufrieden sein. Somit moduliert der Wasseraustausch das beobachtete Relaxationsverhalten, wie durch die Bloch-McConnell-Gleichungen14,15,39,40 beschrieben. Die Erholung der Längsmagnetisierung nach der Inversion ist nicht monoexponentiell und wird ausgedrückt als:

Dabei ist Mz die momentane Magnetisierung, M0 sein Boltzmann-Gleichgewichtswert, aL und R1L sind der Bruchteil und die Geschwindigkeitskonstante für die scheinbare Komponente mit dem längeren T1 (T1L = R1L–1), aS und R1S sind der Bruchteil und die Geschwindigkeitskonstante für die scheinbare Komponente mit dem kürzeren T1 (T1S = R1S–1) und t ist die Laufzeit für die Erholung durch Entspannung. Da aL und aS zusammenhängen (aS + aL = 1), gibt es nur drei unabhängige Parameter: R1L, R1S und aS (oder aL), ausgedrückt als:

Dabei ist R1ex0 die extrazelluläre Relaxationsrate ohne CA, [CA] die millimolare Konzentration des CA im extrazellulären Raum und r1 sein Relaxivitätswert.

Die Gd-Konzentration im Pellet wurde durch eine relaxometrische Methode nach Mineralisierung der Probe über Nacht in 6 M HCl bei 120 °C bestimmt. Die Behandlung bewirkte den Matrixaufschluss und die Freisetzung des Metalls als freies Aquo-Ion. Der R1 dieser Lösung wurde bei 21 MHz und 25 °C auf einem Stelar SpinMaster Relaxometer (Mede, Pavia, Italien) gemessen und die Gd-Konzentration wurde unter Verwendung einer maßgeschneiderten Kalibrierungskurve berechnet, die aus Standardlösungen von GdCl341,42,43 erhalten wurde.

Da sich die Metallkomplexe nur in Vex verteilen, wurde letzteres nach folgender Beziehung bestimmt:

wobei nGd die durch Relaxometrie bestimmte Anzahl von Gd-Molen ist; und MGd ist die Konzentration der den Zellen zugesetzten Gd-HPDO3A-Lösung und Volp ist das Volumen der feuchten Zellpellets.

Für die Aufnahmeexperimente wurden die Zellen wie zuvor für das relaxometrische Experiment beschrieben abgelöst, um ein Pellet aus etwa 2 Millionen Zellen zu erhalten. Zur Na+-Aufnahme wurden die Zellen in 1 ml Puffer (Krebs mit oder ohne Na+) oder Kulturmedium suspendiert und in Gegenwart des Vehikels (DMSO) oder 10 μM Monensin für 15, 30 Minuten inkubiert (37 °C, 5 % CO2). oder 45 Min. Die Zellen wurden dann dreimal mit 15 ml kaltem Krebs-Puffer ohne Na+ gewaschen und durch Zentrifugation (0,2 rcf, 4 °C) erneut ausgefällt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 200 µL bidestilliertem Wasser gewonnen. Im Fall des Rubidium-Aufnahmeexperiments war das Protokoll das gleiche, mit Ausnahme der Anwesenheit von 0,22 mM RbCl in 1 ml Suspensionslösung und der Inkubationszeiten (5, 15 und 30 Minuten).

Nach der Ultraschallbehandlung wurde die Proteinkonzentration der Probe mittels Bradford-Assay bestimmt. Die Zellproben wurden dann nach Zugabe der gleichen Menge HNO3 (70 %) unter Verwendung eines Mikrowellen-Heizprogramms (ETHOS UP Milestone, Bergamo, Italien) verdaut, das aus einem Anstieg auf 150 °C in 8 Minuten bestand, gefolgt von 6 Min. bei 150 °C. Nach der Mineralisierung wurden den Proben 3 ml hochreines Wasser für die ICP-MS-Analyse zugesetzt. Die Quantifizierung von Na+ und Rb+ wurde durch eine ICP-MS-Analyse (Element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italien) durchgeführt. Die Kalibrierungskurven wurden mit Na- und Rb-Standardlösungen (Sigma-Aldrich) im Bereich von 0,7–0,2 μg/ml und 0,2–0,005 μg/ml für Na+ bzw. Rb+ erstellt. Die Ergebnisse wurden als nmol Na+ pro mg Proteine ​​und für Rb als prozentuale Differenz der Rb-Aufnahme im Vergleich zur Kontrolle wie folgt ausgedrückt:

[(nmol Rb+ /mg Protein)t–(nmol Rb+ /mg Protein)c]/(nmol Rb+ /mg Protein)c × 100 wobei t und c jeweils die behandelte Probe und die Kontrollprobe angeben.

Sechs bis acht Wochen alte erwachsene männliche NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (Jackson-Bestandsnr. 005557) (NSG)-Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung der Università del Piemonte Orientale, Abteilung für Gesundheitswissenschaften, gehalten. und gemäß der Ethikkommission der Universität und den europäischen Richtlinien behandelt (Experimentalprotokoll-Genehmigung Nr. 851/2020-PR, veröffentlicht am 19.08.2020 vom italienischen Gesundheitsministerium für Protokoll Nr. DB064.60). Den Mäusen wurden C1C7-Zellen subkutan in den Rücken injiziert (1 × 106 in 100 μl NaCl 0,9 %/Maus) und das Tumorwachstum wurde täglich überwacht. Wenn die Tumorgröße ~80 mm3 betrug (etwa 10 Tage nach der Tumorzellinjektion), wurden Mäuse täglich mit einer intraperitonealen Injektion von Monensin, 4–8–16 mg/kg, gelöst in DMSO/HPCD 10 % in NaCl 0,9 % (1: 9, Vol./Vol.) oder mit Vehikel allein (DMSO/HPCD 10 % in NaCl 0,9 % (1:9, Vol./Vol.). Es wurden 4 Tiere für Gruppen eingesetzt. Zur Schätzung wurden tastbare Tumoren für die Dickenmessung in zwei Dimensionen verwendet Tumorvolumen gemäß der Gleichung V = (L × B x B)/2. Die Behandlung wurde 10 Mal durchgeführt und die Mäuse wurden 2 Stunden nach der letzten Verabreichung oder wenn sie Leiden zeigten, getötet. Am Ende des Experiments, vorher Bei der Organentnahme wurden Mäuse mit Krebs ohne Na+ perfundiert, um mögliche Kontaminationen durch das intravaskuläre Na+ zu beseitigen.

Mausgewebe wurden zur Fixierung in 10 % neutral gepuffertem Formalin gesammelt und in Paraffin eingeschlossen. Knochenmarksproben (BM) wurden 8 Stunden lang mit einer EDTA-basierten Entkalkungslösung entkalkt, in fließendem Wasser gewaschen (1 Stunde) und anschließend verarbeitet und in Paraffin eingebettet. Vier Mikrometer dicke Schnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und mit Hämatoxylin und Eosin für histopathologische Analysen oder mit Anti-Ki-67 (1:250, Ventana® Medical Systems, Roche, Monza, Italien) gefärbt, um die Zellproliferation mithilfe eines zu bewerten automatisierter Immunfärber (Ventana, Roche, Monza, Italien). Diabilder wurden mit dem Diascanner Pannoramic MIDI 1.17 aufgenommen; Objektivtyp: Plan-Apochromat; Vergrößerung: 20X; Kamera: Zeiss ICc1. Die Ki67- und Zellerkennung zur Quantifizierung der Zelldichte (ausgewertet als Zellen/mm2) und der Größe (ausgewertet als EQPC: Durchmesser eines Kreises gleicher Projektionsfläche der Zelle) wurde mit der integrierten „Positive Zellerkennung“ von QuPath durchgeführt. 42,44 Softwareversion: QuPath-0.3.2.

Ein Femur pro Maus wurde gesammelt und in kaltem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 5 % FBS, gehalten. Die BM-Zellen wurden durch Spülen der Knochen mit einer 26G-Nadel geerntet und durch einen 40-μm-Zellfilter geleitet, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellzählung wurde in der Burker-Kammer unter Verwendung von Trypanblau durchgeführt, um tote Zellen auszuschließen. Nach der Zählung wurden die Zellen in FACS-Puffer (PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) resuspendiert. Die Proben wurden mit Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern (Tabelle 1) gegen Mausmarker gefärbt. Für jede Färbung wurde ein Antikörper-Mastermix in FACS-Puffer hergestellt, die Zellen wurden gewaschen und im Mastermix resuspendiert und 15 Minuten bei 4 °C inkubiert. Die Proben wurden mit dem Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Fisher Scientific) entnommen und die Analysen mit der Software FlowJo v10 (BD Biosciences) durchgeführt.

Am Ende der Monensin-Behandlung wurden implantierte Mäuse mit Krebs (- Na+) perfundiert, um mögliche Kontaminationen aufgrund des intravaskulären Na+ zu beseitigen, und dann getötet. Ihre Organe wurden gesammelt, gewogen und in konzentrierter HNO3 (70 %) verdaut. Aliquote der aufgeschlossenen Proben (0,25 ml) wurden durch Erhitzen unter Mikrowellen (ETHOS UP Milestone, Bergamo, Italien) nach einem Programm mineralisiert, das aus einem Anstieg auf 160 °C in 8 Minuten und anschließend 6 Minuten bei 160 °C bestand. Nach der Mineralisierung wurden den Probenvolumina 4 ml Reinstwasser zugesetzt. Die gewonnenen Proben wurden für die ICP-MS-Analyse (Element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italien) entsprechend verdünnt.

MRT-Bilder wurden mit einem 7T Bruker Biospin Pharmascan 70/16-Scanner aufgenommen, der mit einer 1H/23Na-Sende-Empfangs-Oberflächenspule (20 mm Durchmesser) (Bruker, Magnetic Resonance Imaging, Mailand, Italien) ausgestattet war, in Gegenwart einer Referenz mit bekanntem Na+ Konzentration (1 % Agarosegel in Na+-Phosphatpuffer, [Na+] = 75 mM).

Die Oberflächenspule wurde auf einem Rattenbett platziert und entsprechend der HF-Spulenmitte in die Magnetbohrung eingeführt. Die Mäuse wurden mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (Zoletil 100; Vibac, Mailand, Italien) 20 mg/kg und Xylazin (Rompun; Bayer, Mailand, Italien) 5 mg/kg anästhesiert. Mäuse wurden auf die Oberflächenspule gelegt, wobei sich der Tumorbereich in der Mitte der Oberflächenspulensonde befand.

Protonen-T2-gewichtete Bilder wurden mit einer Turbo RARE-Pulssequenz aufgenommen (FOV 30 × 30, MTX 128 × 128, Schichtdicke 3 mm, räumliche Auflösung 0,23 × 0,23 mm2, TE 55 ms, TR 2500 ms, RF 12, Durchschnitt 1). .

Die Na+-Gradientenecho-FLASH-Sequenz wurde mit den folgenden Parametern eingestellt: FOV 30 × 30, MTX 32 × 32, Schichtdicke 3 mm, räumliche Auflösung 0,94 × 0,94 mm2, TE 2,05 ms, TR 50 ms, Durchschnitt 548.

Am ersten Tag des Experiments wurden die 1H- und 23Na-Bilder vor und 2 Stunden nach der Behandlung aufgenommen, die aus einer Monensin-Dosis von 16 mg/kg in PBS (frisch hergestellt aus der 22 mM Stammlösung in DMSO) oder aus bestand die äquivalente Vehikellösung für die Behandlungs- bzw. Kontrollgruppe. In den folgenden Tagen wurden die Bilder 2 Stunden nach der Behandlung aufgenommen. Am Ende des Experiments wurden die Mäuse getötet (ohne Perfusion) und der Na+-Gehalt der wiederhergestellten Tumore wurde wie zuvor beschrieben quantifiziert.

Die Analyse der Bilder wurde mit der präklinischen Bildgebungssoftware Paravision 360 (Bruker) durchgeführt. Für jeden Tag des Experiments wurden die mittleren Signalintensitätswerte (SI) für eine Region of Interest (ROI) berechnet, die manuell über den gesamten Tumor gezogen wurde, und mit der Referenzprobe normalisiert. Die SI-Änderung (prozentuale Änderung) wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: Prozentuale Änderung = [(SIpost – SIpre)]/SIpre × 100, wobei sich „pre“ auf das Bild bezieht, das vor Beginn der Behandlung aufgenommen wurde, und „post“ auf das Bild, das nach 2 aufgenommen wurde h aus der Monensin-Behandlung. Die prozentuale Änderung wurde durch Mittelung der prozentualen Änderung berechnet, die für Mäuse in der Kontroll- bzw. Behandlungsgruppe erhalten wurde. Der millimolare Na+-Gewebegehalt wurde in mmol pro kg Gewebe ausgedrückt, wobei eine Gewebedichte von 1 g/ml angenommen wurde.

Jedes Experiment wurde unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert von drei bis acht unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz zwischen zwei Gruppen wurde durch den ungepaarten oder gepaarten zweiseitigen Student-t-Test oder den Mann-Whitney-U-Test bestimmt. Für den Mehrgruppen- und Zeitverlaufsvergleich wurden eine einfaktorielle ANOVA oder eine zweifaktorielle ANOVA verwendet. Die Verteilungsnormalität aller Gruppen wurde vorläufig mit dem Kolmogorov- und Smirnov-Test überprüft. Die Signifikanz wurde auf dem 5 %-Niveau festgestellt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). Für statistische Analysen wurden GraphPad Prism v.8.4.3 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) und OriginPro (Version 2023. OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die numerische Quelle aller in den Diagrammen angezeigten Daten ist in der Zusatzdatendatei enthalten.

Yang, JD et al. Eine globale Sicht auf das hepatozelluläre Karzinom: Trends, Risiko, Prävention und Management. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 16, 589–604 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, H., Zhang, W., Jiang, L. & Chen, Y. Jüngste Fortschritte in der systemischen Therapie des hepatozellulären Karzinoms. Biomark. Res. 10, 3–10 (2019).

Artikel Google Scholar

Vogel, A. & Saborowski, A. Medizinische Therapie des HCC. J. Hepatol. 76, 208–210 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Webb, BA, Chimenti, M., Jacobson, MP & Barber, DL Dysregulierter pH-Wert: ein perfekter Sturm für das Fortschreiten von Krebs. Nat. Rev. Cancer 11, 671–677 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parks, SK, Chiche, J. & Pouysségur, J. Störung der Protonendynamik und des Energiestoffwechsels für die Krebstherapie. Nat. Rev. Cancer 13, 611–623 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carini, R. et al. Veränderung der Na+-Homöostase als entscheidender Schritt bei der Entwicklung einer irreversiblen Hepatozytenschädigung nach Adenosintriphosphat-Depletion. Hepatology 21, 1089–1098 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Carini, R. & Albano, E. Aktuelle Erkenntnisse zu den Mechanismen der Lebervorkonditionierung. Gastroenterology 125, 1480–1491 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Carini, R., Autelli, R., Bellomo, G. & Albano, E. Veränderungen der Zellvolumenregulation bei der Entwicklung von Hepatozytennekrose. Exp. Zellauflösung 248, 280–293 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cameron, IL, Smith, NK, Pool, TB & Sparks, RL Intrazelluläre Konzentration von Na+ und anderen Elementen im Zusammenhang mit Mitogenese und Onkogenese in vivo. Krebs Res. 40, 1493–1500 (1980).

CAS PubMed Google Scholar

Ouwerkerk, R., Bleich, KB, Gillen, JS, Pomper, MG & Bottomley, PA Gewebe-Na+-Konzentration in menschlichen Hirntumoren, gemessen mit 23Na-MR-Bildgebung. Radiologie 227, 529–537 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Barrett, T. et al. Quantifizierung der Gesamt- und [Na+]i-Konzentration bei primärem Prostatakrebs und angrenzendem normalem Prostatagewebe mittels Magnetresonanztomographie. Investieren. Radiol. 53, 450–456 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

James, AD et al. Die Anreicherung von Na+ bei Brustkrebs sagt Malignität und das Ansprechen auf die Behandlung voraus. Br. J. Cancer 127, 337–349 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, L. et al. Na+-MRT bei 7T zur Beurteilung des frühen Ansprechens intrakranieller Tumoren nach stereotaktischer Strahlentherapie mit dem cyberKnife. AJNR Am. J. Neuroradiol. 43, 181–187 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charles, S. Springer, verwenden 1H2O MR zur Messung und Kartierung der Na+-Pumpaktivität in vivo. J. Magn. Resonanz. 291, 110–126 (2018).

Artikel Google Scholar

Li, Magn. Resonanz. Med. 82, 411–424 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruggiero, MR et al. Belege für die Rolle der intrazellulären Wasserlebensdauer als Tumorbiomarker, erhalten durch In-vivo-Feld-Zyklus-Relaxometrie. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 57, 7468–7472 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruggiero, MR et al. Intrazelluläre Wasserlebensdauer als Tumorbiomarker zur Überwachung der Doxorubicin-Behandlung mittels FFC-Relaxometrie in einem Brustkrebsmodell. Vorderseite. Oncol. 11, 778823 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruggiero, MR, Baroni, S., Aime, S. & Geninatti Crich, S. Relaxometrische Untersuchungen zur Bestimmung der intrazellulären Wasserlebensdauer: ein neuartiger Tumorbiomarker mit allgemeiner Anwendbarkeit. Mol. Physik. 1, 1–7 (2019).

Google Scholar

Riddell, FG Struktur, Konformation und Mechanismus beim Membrantransport von Alkalimetallionen durch ionophore Antibiotika. Chirality 14, 121–125 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J. und Huczyński, A. Doxycyclin, Salinomycin, Monensin und Ivermectin als Krebsmedikamente neu positioniert. Bioorg. Med. Chem. Lett. 29, 1549–1554 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tumova, L. et al. Monensin hemmt die kanonische Wnt-Signalübertragung in menschlichen Darmkrebszellen und unterdrückt das Tumorwachstum bei Mäusen mit multipler intestinaler Neoplasie. Mol. Krebs Ther. 13, 812–822 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, Y. et al. Das Antibiotikum Monensin wirkt synergetisch mit EGFR-Inhibitoren und Oxaliplatin, um die Proliferation menschlicher Eierstockkrebszellen zu unterdrücken. Wissenschaft. Rep. 5, 17523 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X. et al. Monensin hemmt die Zellproliferation und das Tumorwachstum chemoresistenter Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, indem es auf den EGFR-Signalweg abzielt. Wissenschaft. Rep. 8, 17914 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yao, S. et al. Monensin unterdrückt die Zellproliferation und -invasion bei Eierstockkrebs, indem es die MEK1-SUMOylierung verstärkt. Exp. Dort. Med. 22, 1390 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, J. et al. Neue Rollen und die Regulierung der aeroben Glykolyse beim hepatozellulären Karzinom. J. Exp. Klin. Krebs Res. 39, 126 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leslie, TK et al. Natriumhomöostase in der Tumormikroumgebung. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1872, 188304 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Henderson, PJ, McGivan, JD & Chappell, JB Die Wirkung bestimmter Antibiotika auf Mitochondrien-, Erythrozyten- und künstliche Phospholipidmembranen. Die Rolle der induzierten Protonenpermeabilität. Biochem. J. 111, 521–535 (1969).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Antonenko, YN, Rokitskaya, TI & Huczyński, A. Elektrogene und nichtelektrogene Ionenflüsse durch Lipid- und Mitochondrienmembranen, vermittelt durch Monensin und Monensinethylester. Biochim. Biophys. Acta 1848, 995–1004 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shi, Y. et al. Gboxin ist ein Inhibitor der oxidativen Phosphorylierung, der auf Glioblastome abzielt. Natur 567, 341–346 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinberg, SE & Chandel, NS Targeting des Mitochondrienstoffwechsels für die Krebstherapie. Nat. Chem. Biol. 11, 9–15 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Souza, AC et al. Mitochondrialer Schaden als frühes Ereignis einer Monensin-induzierten Zellschädigung in kultivierten Fibroblasten L929. J. Tierarzt. Med. Ein Physiol. Pathol. Klin. Med. 52, 230–237 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van der Valk, J. et al. Fetales Rinderserum (FBS): Vergangenheit – Gegenwart – Zukunft. ALTEX 35, 99–118 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Gupta, PB et al. Identifizierung selektiver Inhibitoren von Krebsstammzellen durch Hochdurchsatz-Screening. Zelle 138, 645–659 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanneste, M. et al. Ein High-Content-Screening identifiziert Monensin als EMT-selektive zytotoxische Verbindung. Wissenschaft. Rep. 9, 1200 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Blain, M. et al. Überleben nach schwerer Rhabdomyolyse nach Einnahme von Monensin. J. Med. Toxicol. 13, 259–262 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldeira, C. et al. Rhabdomyolyse, akutes Nierenversagen und Tod nach Einnahme von Monensin. Bin. J. Nierendis. 38, 1108–1112 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Todd, GC, Novilla, MN & Howard, LC Vergleichende Toxikologie von Monensin-Natrium bei Labortieren. J. Anim. Wissenschaft. 58, 1512–1517 (1984).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Urbaniak, A. et al. Anti-Glioblastom-Aktivität von Monensin und seinen Analoga in einem Organoid-Krebsmodell. Biomed. Pharmakotherapeut. 153, 113440 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mandili, G. et al. Maushepatozyten und LSEC-Proteom offenbaren neue Mechanismen der Ischämie-/Reperfusionsschädigung und des Schutzes durch A2aR-Stimulation. J. Hepatol. 62, 573–580 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ye, F. & Hoppel, CL Messung der oxidativen Phosphorylierung in menschlichen Hautfibroblasten. Anal. Biochem. 437, 52–58 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

CS Springer Jr, et al. Intratumorkartierung der intrazellulären Wasserlebensdauer: Stoffwechselbilder von Brustkrebs? NMR Biomed. 27, 760–773 (2014).

Landis, CS et al. Gleichgewichtskinetik des transzytolemmalen Wasseraustauschs im Skelettmuskel in vivo. Magn. Resonanz. Med. 42, 467–478 (1999).

3.0.CO;2-0" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291522-2594%28199909%2942%3A3%3C467%3A%3AAID-MRM9%3E3.0.CO%3B2-0" aria-label="Article reference 42" data-doi="10.1002/(SICI)1522-2594(199909)42:33.0.CO;2-0">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cabella, C. et al. Zellmarkierung mit Gd(III)-Chelaten: Nur hohe thermodynamische Stabilitäten verhindern, dass die Zellen als „Schwämme“ von Gd3+-Ionen fungieren. Kontrastmittel Mol. Bildgebung 1, 23–29 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bankhead, P. et al. QuPath: Open-Source-Software für die Bildanalyse in der digitalen Pathologie. Wissenschaft. Rep. 7, 16878 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC, gewährt IG-2020-24351 an RC), vom italienischen Gesundheitsministerium (Zuschuss Nr. RF-2018-12366471 an AF) und von der Fondazione Cariplo (Zuschuss Nr. 2018-0253) unterstützt zu CB).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nausicaa Clemente, Simona Baroni.

Abteilung für Gesundheitswissenschaften der Universität Ostpiemont, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italien

Nausicaa Clemente, Simone Fiorilla, Francesco Tasso, Chiara Borsotti, Gillian Walker, Antonia Follenzi und Rita Carini

Abteilung für Molekulare Biotechnologie und Gesundheitswissenschaften, Universität Turin, Via Nizza, 52, 10126, Turin, Italien

Simona Baroni, Maria Rosaria Ruggiero und Simonetta Geninatti Crich

Abteilung für Translationale Medizin, Abteilung für Muskelbiologie, Universität Ostpiemont, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italien

Simone Reano

Abteilung für experimentelle Onkologie/Abteilung für Urologie, URI, IRCCS, Ospedale San Raffaele, Mailand, Italien

Elisa Alchera

Abteilung für Gesundheitswissenschaften und interdisziplinäres Forschungszentrum für Autoimmunerkrankungen (IRCAD), Universität Ostpiemont, Via Solaroli, 17, 28100, Novara, Italien

Marco Corrazzari

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

NC führte die In-vivo-Experimente durch und analysierte die Daten. FT, SF und EA führten die In-vitro-Experimente durch und analysierten die Daten. SR führte die hochauflösende Respirometrieanalyse durch und analysierte die Daten, während SF konfokale In-vivo-Bildgebung und immunhistochemische Analysen durchführte. MC trug zur In-vivo-Bildgebungsanalyse bei, während CB und GW die Hämatopoese-Experimente durchführten und Daten analysierten. MRR und SB führten die relaxometrische Erfassung und die ICP-MS-Analysen durch und analysierten die Daten. SB und SG führten 23Na-MRT-Studien durch und analysierten Daten. SG konzipierte und überwachte die ICP-MS-, relaxometrischen NMR- und 23Na-MRT-Experimente. SG, AF, CB, GW und SB überprüften und redigierten das Manuskript, wobei SG, AF und RC die Studie überwachten. RC konzipierte die Studie, stellte die Finanzierung bereit und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Simonetta Geninatti Crich oder Rita Carini.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Charles S. Springer und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Clemente, N., Baroni, S., Fiorilla, S. et al. Die Erhöhung des intrazellulären Natriums tötet selektiv Hepatokarzinomzellen ab und induziert bei Mäusen eine Schrumpfung des hepatozellulären Karzinomtumors. Commun Biol 6, 574 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04946-4

Zitat herunterladen

Eingegangen: 29. November 2022

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04946-4

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.