Strategie zur Steigerung der Wirksamkeit von Doxorubicin in soliden Tumorzellen durch Methyl

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 11853 (2015) Diesen Artikel zitieren

4555 Zugriffe

102 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Doxorubicin (DOX) ist eines der bevorzugten Medikamente zur Behandlung von Brust- und Leberkrebs. Allerdings ist seine klinische Anwendung aufgrund schwerwiegender Nebenwirkungen und der damit einhergehenden Arzneimittelresistenz begrenzt. In diesem Zusammenhang untersuchten wir die Auswirkung des cholesterinabbauenden Wirkstoffs Methyl-β-Cyclodextrin (MCD) auf die therapeutische Wirksamkeit von DOX und untersuchten die Beteiligung von p53. MCD sensibilisiert MCF-7- und Hepa1–6-Zellen für DOX. Die Kombination von MCD und einer marginalen DOX-Dosis verringert die Lebensfähigkeit der Zellen und fördert die Apoptose durch Induktion des proapoptotischen Proteins Bax, Aktivierung von Caspase-8 und Caspase-7 und Herunterregulierung des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 und fördert schließlich die PARP-Spaltung. Mechanistisch gesehen war die Sensibilisierung gegenüber DOX durch MCD auf die Induktion des FasR/FasL-Signalwegs durch p53-Aktivierung zurückzuführen. Darüber hinaus schwächte die Hemmung von p53 durch den pharmakologischen Inhibitor Pifithrin-α (PFT-α) oder seine spezifische siRNA die p53-Funktion ab und regulierte FasR/FasL herunter, wodurch der Zelltod verhindert wurde. Tierversuche wurden mit C57BL/6J-Mäusen durchgeführt, denen Hepa1–6-Zellen isotransplantiert waren. Bei Mäusen, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde, war das Tumorwachstum verzögert und die Überlebensrate höher als bei Mäusen, denen beide Wirkstoffe allein verabreicht wurden. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass MCD die Empfindlichkeit gegenüber DOX erhöht, für das Wildtyp-p53 eine wichtige Determinante ist.

Brustkrebs und hepatozelluläres Karzinom (HCC) sind die zweit- bzw. fünfthäufigsten Krebsarten und die Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle auf der ganzen Welt1,2,3. Obwohl die chirurgische Entfernung von Tumoren nach wie vor die primäre Behandlungsmethode der Wahl ist, bleibt die Chemotherapie neben einer Operation oder Strahlentherapie die wirksamste Methode, um das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen zu verhindern und so das Überleben von Krebspatienten zu verbessern4. Eine der größten Einschränkungen chemotherapeutischer Medikamente ist die Toxizität aufgrund einer hohen Dosierung oder einer unzureichenden Wirksamkeit der Medikamente gegenüber Tumorzellen5. Daher sind neue Strategien zur Erzielung eines günstigen Ansprechens auf eine Chemotherapie zur Verbesserung der Prognose von Brust- und Leberkrebs dringend wünschenswert.

Doxorubicin (DOX), ein Anthracyclin-Antibiotikum, ist seit zwanzig Jahren eines der wirksamsten und am häufigsten verwendeten Chemotherapeutika zur Behandlung verschiedener bösartiger Erkrankungen, einschließlich Brust und Leber6. Die häufigsten Nachteile bei der klinischen Anwendung von DOX sind jedoch Kardiotoxizität und Knochenmarksdepression bei höheren Dosen7. DOX induziert Apoptose in Krebszellen durch DNA-Schädigung, Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies, Stillstand des Zellzyklus und Aktivierung von p538,9,10,11,12. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Expression von Wildtyp-p53 für die zytotoxische Reaktion auf Chemotherapeutika essentiell ist. Als Wächter des Genoms wird der Tumorsuppressor p53 bei der DOX-Behandlung aktiviert und fungiert als Transkriptionsfaktor, wodurch er nachgeschaltete Zielgene wie BAX, PUMA und MDM reguliert213,14,15. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass einige neuartige Kombinationstherapien besser für die Behandlung von Krebserkrankungen geeignet sind, ohne Nebenwirkungen auf normales Gewebe auszulösen16,17. Es wurden Versuche unternommen, Chemosensibilisierungsmittel zu identifizieren, die die Wirksamkeit von DOX steigern und dadurch die DOX-Dosen reduzieren könnten. Verschiedene Wirkstoffe wie Curcumin, IFN-α, Quercetin, Selenocystin und Ocotillol wurden untersucht, um die Antitumoraktivität von DOX durch p53-Aktivierung zu verstärken18,19,20,21,22.

Die Techniken zur Medikamentenverabreichung speziell für Krebszellen haben in den letzten Jahren große Aufmerksamkeit erhalten. In dieser Studie haben wir Cyclodextrin (CD) verwendet, das durch enzymatische Reaktion von Stärke produziert wird. Unter allen Arten von Cyclodextrin ist Methyl-β-Cyclodextrin (MCD) ein zyklisches Heptasaccharid, das aus äußeren hydrophilen und inneren hydrophoben Hohlräumen besteht23,24. MCD ist in der pharmazeutischen Industrie sowie in der biologischen Forschung am zugänglichsten und wird am häufigsten eingesetzt, da es die Löslichkeit, Abgabe und Bioverfügbarkeit vieler Moleküle, einschließlich Arzneimittel, erhöht. Aufgrund seiner hohen Affinität dazu ist es das wirksamste Mittel zur Entfernung von Plasmamembran-Cholesterin25. Wir haben zuvor berichtet, dass MCD die therapeutische Wirksamkeit von 5-Flurouracil, Carboplatin und Tamoxifen steigert26,27. Darüber hinaus wurde in anderen Studien auch berichtet, dass MCD oder seine modifizierten Formen die zytotoxische Wirkung verschiedener Medikamente verstärken können28,29. In dieser Studie untersuchten wir die Fähigkeit von MCD, die therapeutische Wirksamkeit von DOX in Brust- und Leberkrebszellen sowohl durch In-vitro- als auch In-vivo-Studien zu steigern. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von MCD und DOX die Zellproliferation durch Förderung der Apoptose reduziert. Mechanistisch gesehen fungiert MCD als potenzieller Chemosensibilisator, indem es den DOX-induzierten Zelltod durch Aktivierung von p53 und Induktion des FasR/FasL-Signalwegs verstärkt.

Um zu untersuchen, ob MCD schädliche Auswirkungen auf MCF-7- und Hepa1–6-Zellen hat, wurden Screening-Experimente durchgeführt, um die ungiftige Konzentration und den optimalen Zeitpunkt von MCD zu bestimmen, der für die Verwendung in einer Kombinationsbehandlung geeignet ist. Die 4-stündige Behandlung von Zellen mit verschiedenen MCD-Konzentrationen (2,5 mM bis 10 mM) hemmte das Zellüberleben in dosisabhängiger Weise, gemessen durch MTT-Assay (Abb. 1A, D). MCD war bei einer Dosis von 10 mM im Vergleich zu 2,5 und 5 mM hochtoxisch für Zellen, daher wurde für weitere Experimente eine Konzentration von 5 mM verwendet. Darüber hinaus wurde die Grenzdosis von DOX für die Verwendung im Kombinationsschema in mit DOX behandelten Zellen für beide Zellen auf 2,5 μM berechnet (Daten nicht gezeigt). Da DOX zur Behandlung von Brustkrebs und HCC eingesetzt wird, muss ein Ansatz zur Verbesserung des therapeutischen Index von DOX bei niedrigeren Dosen definiert werden. Wir untersuchten die Kombinationseffekte von MCD auf die DOX-induzierte Wirkung in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit MCD zusammen mit einer IC50-Dosis DOX behandelt. Wie erwartet verringerte sich die Lebensfähigkeit der Zellen bei einer IC50-Dosis von DOX um 50 %, was in Gegenwart von MCD weiter auf weniger als 5 % reduziert wurde, und diese Ergebnisse wurden auch durch einen klonogenen Langzeittest bestätigt (Abb. 1B, E, C, F). Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen einer niedrigen Dosis (1 μM) DOX zusammen mit MCD (5 mM) auf die Lebensfähigkeit von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen und beobachteten eine signifikante Verringerung des Zellüberlebens im Vergleich zu MCD und DOX allein (Abb . 1B,E). Ähnliche Ergebnisse wurden auch im klonogenen Langzeittest beobachtet (Abb. 1C, F). Der Anstieg des MCD-potenzierten DOX-induzierten Effekts war auf die Induktion von Apoptose in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen zurückzuführen, wie aus der grafischen Darstellung der FACS-Daten hervorgeht und das Balkendiagramm den Prozentsatz Annexin-positiver Zellen darstellt (Abb. 1G, H). In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen verursachte die Kombinationsbehandlung auch eine PARP-Spaltung, eine Abnahme des Proteinspiegels des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 und eine Hochregulierung des proapoptotischen Proteins Bax (Abb. 1I). Caspasen spielen sowohl bei intrinsischen als auch bei extrinsischen apoptotischen Signalwegen eine wichtige Rolle. Daher stellten wir bei der Untersuchung der Proteinspiegel von Caspasen in MCF-7 und Hepa1–6 fest, dass MCD zusammen mit DOX Caspase-8 und Caspase-7 aktiviert (Abb. 1J). Alle oben genannten Ergebnisse zeigen, dass MCD die DOX-induzierte Zytotoxizität nur in Krebszellen (MCF-7 und Hepa1–6) und nicht in normalen Hepatozytenzellen (AML12) verstärkt (ergänzende Abbildung 2A-D).

MCD verstärkt die Wirkung von DOX und induziert Apoptose in Brust- und Leberkrebszellen.

(A) MCF-7- und (D) Hepa1–6-Zellen wurden 4 Stunden lang mit den angegebenen MCD-Konzentrationen (2,5–10 mM) behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT-Assay gemessen. (B) MCF-7- und (E) Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen DOX-Konzentrationen zusammen mit MCD behandelt und einem MTT-Assay unterzogen. (C) MCF-7- und (F) Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen DOX-Konzentrationen zusammen mit MCD behandelt und die Zellen wurden einem klonogenen Langzeittest unterzogen. (G) MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen DOX-Konzentration zusammen mit MCD behandelt und apoptotische Zellen wurden durch Annexin V-FITC-Färbung mittels Durchflusszytometrie analysiert. (H) Quantifizierung von Annexin V-FITC-positiven Zellen. (I) MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen DOX-Konzentration zusammen mit MCD behandelt. Die Zellen wurden geerntet, die Lysate ganzer Zellen wurden einem Immunoblot unterzogen und die Proteingehalte von PARP, Bax und Bcl-2 wurden bewertet. Als Belastungskontrolle diente Hsp60. (J) MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen DOX-Konzentration zusammen mit MCD behandelt. Die Zellen wurden geerntet, die Lysate ganzer Zellen wurden einem Immunoblot unterzogen und die Proteingehalte von Caspase-8 und Caspase-7 sowie deren gespaltene Form wurden bewertet. Als Belastungskontrolle diente Hsp60. In der Hauptabbildung werden abgeschnittene Blots verwendet und in der Zusatzabbildung 1 sind Volllängen-Blots enthalten. Das gesamte Balkendiagramm stellt den Mittelwert ± SD eines in dreifacher Ausfertigung durchgeführten Experiments dar (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001).

Um den möglichen Mechanismus der MCD-potenzierten DOX-induzierten Zytotoxizität zu untersuchen, untersuchten wir die Wirkung von MCD auf die intrazelluläre Aufnahme von DOX mittels Durchflusszytometrie. Die Menge an DOX in der Zelle ist direkt proportional zu ihrer Fluoreszenz, da DOX ein selbstfluoreszierendes Medikament ist. Die Messung der Fluoreszenzintensität von DOX wurde verwendet, um die Zellaufnahme in den Zellen zu bewerten30. Obwohl DOX als solches von den Zellen aufgenommen wird, wurde die zelluläre Aufnahme von DOX nach der Behandlung mit MCD interessanterweise deutlich erhöht, wie aus der grafischen Darstellung der FACS-Daten hervorgeht und das Balkendiagramm die mittlere rote Fluoreszenz darstellt (Abb. 2A, B). Die Verstärkung der Anreicherung von DOX durch MCD wurde durch ein Fluoreszenzmikroskop weiter bestätigt (Abb. 2C, D). MCD verstärkte die DOX-Aufnahme in AML12-Zellen nicht (Ergänzende Abbildung 2E-F).

MCD erhöht die intrazelluläre Aufnahme von DOX in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen.

MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wurden mit der angegebenen DOX-Konzentration zusammen mit MCD behandelt. (A) Repräsentatives durchflusszytometrisches Histogramm der intrazellulären Aufnahme von DOX in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen. (B) Das Balkendiagramm ist repräsentativ für die relative Quantifizierung der DOX-Aufnahme in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen. (C) MCF-7- und (D) Hepa1–6-Zellen wurden einer konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie zum Nachweis der intrazellulären Aufnahme von DOX unterzogen.

Stressinduziertes p53 fördert den Zelltod und ist ein wichtiger molekularer Mechanismus von Antitumormitteln wie DOX31. Wir untersuchten die Rolle von p53 bei der Potenzierung des DOX-induzierten Zelltods durch MCD in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen mittels Western-Blot-Analyse. In Zellen, die nur mit MCD und DOX behandelt wurden, wurde ein relativ geringerer p53-Proteinspiegel festgestellt, wohingegen die Kombinationsbehandlung mit MCD und DOX den p53-Proteinspiegel signifikant erhöhte und den Proteinspiegel von MDM2 senkte, einem Protein, das am Abbau von p53 beteiligt ist (Abb. 3A). Darüber hinaus wurde eine erhöhte p53-Expression und ihre Lokalisierung im Zellkern durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt (Abb. 3B, C). Die Aktivierung von p53 bei DNA-Schäden führt zur Hochregulierung mehrerer Proteine. Unter diesen wurde gezeigt, dass das Todesrezeptorprotein FasR in einer Reihe von Krebszellen nach genotoxischem Stress hochreguliert wird32,33,34. Darüber hinaus erhöht p53 auch den FasR-Spiegel auf der Plasmamembran, indem es den Transport von FasR aus dem Golgi-Kanal fördert35. Der Status von FasR wurde durch Durchflusszytometrie und Western-Blot-Analyse bestimmt und wir beobachteten, dass DOX und MCD zusammen die Expression von FasR im Vergleich zu jedem Wirkstoff allein in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen signifikant erhöhten (Abb. 3D, E). Darüber hinaus überprüften wir auch den FasL-Proteingehalt in Zelllysaten und seine sekretierte Form im Kulturmedium, das aus den Zellen durch Western Blot bzw. durch indirekten ELISA entnommen wurde. Die Expression von FasL in Ganzzelllysaten sowie im Kulturmedium war nach gemeinsamer Behandlung mit DOX und MCD erhöht (Abb. 3E,F).

MCD verstärkt den DOX-induzierten Tod von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen in p53-abhängiger Weise durch Hochregulierung von FasR/FasL.

MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen DOX-Konzentration zusammen mit MCD behandelt. (A) Die Proteingehalte von p53 und MDM2 wurden durch Western-Blot-Analyse untersucht. Hsp60 diente als interne Kontrolle und wurde als Beladungskontrolle verwendet. (B) MCF-7- und (C) Hepa1–6-Zellen wurden zur Immunfärbung verarbeitet, um die p53-Expression und ihre Kernlokalisation durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie nachzuweisen. (D) Die Färbung der FasR-Membran wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. (E) Die Proteingehalte von FasR und FasL wurden durch Western-Blot-Analyse untersucht und Hsp60 wurde als Beladungskontrolle verwendet. (F) Sandwich-ELISA zur Quantifizierung von sekretiertem FasL aus Kulturmedium von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen. Das Balkendiagramm stellt den Mittelwert ± Standardabweichung eines in dreifacher Ausfertigung durchgeführten Experiments dar. In der Hauptabbildung werden abgeschnittene Blots verwendet und in der ergänzenden Abbildung 3 sind Blots in voller Länge enthalten.

Wir untersuchten, ob p53 direkt an der Verstärkung des DOX-induzierten Zelltods durch MCD beteiligt ist. Die Behandlung von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen mit dem Inhibitor von p53, Pifithrin-α (PFT-α) bei 20 μM über 24 Stunden zeigte keine signifikante Zytotoxizität, wie durch MTT-Assay bewertet (Abb. 4A, D). Wenn Zellen mit MCD, gefolgt von PFT-α und anschließender Behandlung mit DOX vorbehandelt wurden, stieg die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant an, wohingegen MCD zusammen mit DOX den Zelltod förderte, wie durch MTT-Assay beurteilt (Abb. 4B, E). Durch einen klonogenen Langzeittest wurde in mit MCD, PFT-α und DOX behandelten Zellen eine höhere Anzahl überlebender Kolonien beobachtet als in MCD plus DOX (Abb. 4C, F). Darüber hinaus spielte PFT-α keine Rolle bei der zellulären Aufnahme von DOX, wie die grafische Darstellung der FACS-Daten zeigt und das Balkendiagramm die mittlere rote Fluoreszenz darstellt (Abb. 4G, H). Darüber hinaus waren die p53-Proteinspiegel nach der gleichzeitigen Behandlung von MCD und DOX in Gegenwart von PFT-α im Vergleich zur MCD- und DOX-Behandlung deutlich verringert und das MDM2-Protein erhöht. (Abb. 4I und J; S. 53 und MDM2-Panel, hervorgehoben durch rechteckigen Block). Da es sich bei FasR/FasL um stromabwärts gelegene Moleküle von p53 handelt, waren ihre Konzentrationen auch in mit MCD, DOX und PFT-α behandelten Zellen deutlich reduziert (Abb. 4I, J; FasR- und FasL-Panel, hervorgehoben durch rechteckigen Block). Um die Spezifität von p53 bei der Regulierung von FASR/FasL zu ermitteln, wurden MCF-7-Zellen mit spezifischer p53-siRNA transfiziert. Wie in Abb. 5K gezeigt, waren in den mit p53-siRNA transfizierten Zellen die p53- und Fas/FasL-Proteinspiegel signifikant verringert, wohingegen die MDM2-Spiegel im Vergleich zu den mit siRNA transfizierten Kontrollzellen erhöht waren (Abb. 5K; p53- und MDM2-Panels, hervorgehoben). durch rechteckigen Block).

Die Stummschaltung von p53 reduziert den durch MCD-sensibilisierten DOX verursachten Zelltod und die Herunterregulierung von FasR/FasL.

(A) MCF-7- und (D) Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von PFTα (10–80 μM) behandelt und das Zellüberleben wurde mittels MTT-Assay bewertet. (B) MCF-7- und (E) Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen Konzentration an MCD, PFT-α und DOX behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT-Assay gemessen. (C) MCF-7- und (F) Hepa1–6-Zellen wurden wie angegeben mit MCD, PFT-α und DOX behandelt und ein klonogener Langzeittest wurde unter Verwendung von Kristallviolett durchgeführt. (G) Repräsentatives durchflusszytometrisches Histogramm der intrazellulären Aufnahme von DOX in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen, die mit MCD, PFT-α und DOX behandelt wurden. (H) Das Balkendiagramm ist repräsentativ für die relative Quantifizierung der DOX-Aufnahme in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen. (I) MCF-7- und (J) Hepa1–6-Zellen wurden 24 Stunden lang mit der angegebenen Konzentration an MCD, PFT-α und DOX behandelt, die Proteinspiegel von p53, MDM2, FasR und FasL wurden durch Western-Blot-Analyse untersucht. Als Belastungskontrolle diente Hsp60. (K) MCF-7-Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit p53-siRNA transfiziert. Nach 18 Stunden Transfektion wurden die Zellen 24 Stunden lang gemeinsam mit MCD und DOX exponiert und Gesamtzelllysate wurden hergestellt und auf p53, MDM2, FasR und FasL immungeblottet. Als Belastungskontrolle diente Hsp60. Balkendiagramme stellen (Mittelwert ± Standardabweichung) Experimente dar, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. In der Hauptabbildung werden abgeschnittene Blots verwendet und in der ergänzenden Abbildung 5 sind Blots in voller Länge enthalten.

Die Kombination von MCD und DOX hemmt das Wachstum von Hepa1–6-isotransplantierten Tumoren in C57BL/6J-Mäusen.

Von Hepa1–6-Zellen abgeleitete Tumoren wurden in C57BL/6J-Mäusen entwickelt. Tumortragenden Mäusen wurde normale Kochsalzlösung, 64 mg/kg MCD (ip/alternativer Tag), 1 mg/kg DOX (ip jeden zweiten Tag) und eine Kombination aus MCD und DOX verabreicht. (A) Tumorentstehung und -progression (B) Veränderungen des Körpergewichts (C) Mittleres Gesamtüberleben von Mäusen (D) Repräsentative Panels der H&E-Färbung wichtiger lebenswichtiger Organe wie Herz, Leber, Niere und Lunge von Mäusen (10-fache Vergrößerung). (E) Western-Blot-Analyse der angegebenen Proteine (p53, MDM2, FasR, FasL, Bcl-2, Bax und Hsp60) aus Tumorlysaten von Mäusen, denen MCD, DOX und eine Kombination aus beiden verabreicht wurde. (F) Eine repräsentative immunhistochemische Analyse von CD31, Ki67 und Apoptose in Tumorschnitten wurde durch TUNEL-Färbung untersucht. Mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) blau gefärbte Zellkerne (60-fache Vergrößerung). Der TUNEL-Assay zeigt einen induzierten apoptotischen Kern (grün) in Tumoren von Mäusen, denen MCD und DOX zusammen verabreicht wurden. (G) Balkendiagramm (Mittelwert ± SD), das die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl CD31-, Ki67- und TUNEL-positiver Zellen zeigt, die von der Image J-Software aus verschiedenen Feldern ausgewählt wurden. In der Hauptabbildung werden abgeschnittene Blots verwendet und in der ergänzenden Abbildung 6 sind Blots in voller Länge enthalten.

Um den Kombinationseffekt von MCD und DOX auf das Tumorwachstum zu bewerten, wurden C57BL/6J-Mäusen Hepa1–6-Zellen in die rechte Flanke isotransplantiert. Als die Tumoren bei allen Mäusen ein durchschnittliches Volumen von etwa 70 mm3 erreichten, wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt. Tumortragenden Mäusen wurde 18 Tage lang MCD (64 mg/kg, jeden zweiten Tag, intraperitoneal), DOX (1 mg/kg, jeden zweiten Tag 4 Stunden vor der Injektion von MCD, intraperitoneal) oder eine Kombination aus beidem verabreicht 9 Behandlungen). Die alleinige Verabreichung von MCD und DOX hemmte das Tumorwachstum nicht und das Tumorwachstumsmuster war ähnlich. Allerdings schritt der Tumor bei Mäusen, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde, langsam voran, und das Tumorvolumen war im Vergleich zu Tumoren bei Mäusen, denen eines der beiden Wirkstoffe allein verabreicht wurde, um etwa 50 % reduziert (Abb. 5A). Bei Mäusen, denen MCD, DOX oder eine Kombination aus beidem verabreicht wurde, wurden keine sichtbaren Toxizitätszeichen beobachtet, wie durch Überwachung des Körpergewichts im Verlauf des Experiments bestimmt (Abb. 5B). Interessanterweise war bei den Mäusen, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde, nicht nur das Tumorvolumen verringert, sondern auch die Überlebensfähigkeit der Mäuse in dieser Gruppe war im Vergleich zu Mäusen in anderen Gruppen verbessert (Abb. 5C). Darüber hinaus wurden bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) keine offensichtlichen histopathologischen Anomalien in den lebenswichtigen Organen wie Herz, Leber, Niere und Lunge beobachtet. (Abb. 5D). Wir führten auch eine Western-Blot-Analyse in den Tumorlysaten durch. Es wurde beobachtet, dass die Spiegel von p53, FasR, FasL und Bax erhöht waren, wohingegen ein Rückgang der MDM2- und Bcl-2-Spiegel festgestellt wurde, wobei das Muster mit den Ergebnissen von In-vitro-Experimenten identisch war, wie in Abb. 5E gezeigt. Darüber hinaus wurde durch Immunhistochemie (IHC) eine Abnahme der Expression von CD31 (Endothelmarker) und Ki67 (Proliferationsmarker) in den Tumorabschnitten von Mäusen festgestellt, denen MCD und DOX zusammen verabreicht wurden, im Vergleich zu jedem Wirkstoff allein (Abb. 5F; Ki67 und CD31). Panel). Um schließlich Erkenntnisse darüber zu gewinnen, ob diese Kombinationsbehandlung die Apoptose in Tumoren wirksam fördert, wurden Tumorabschnitte einem TUNEL-Assay (Terminal Desoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling) unterzogen. Die erhöhte Anzahl TUNEL-positiver Zellen wurde deutlich bei Mäusen beobachtet, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde, im Vergleich zu jedem Wirkstoff allein (Abb. 5F, TUNEL-Panel). Die quantitative Analyse der immunhistochemischen Färbung von CD31, Ki67 und denen von TUNEL-positiven Zellen ist in Abb. 5G dargestellt.

Trotz umfangreicher Fortschritte bei der Behandlung von Brust- und Leberkrebs liegt die Heilungsrate dieser Krebsarten bei weitem nicht auf dem gewünschten Niveau. Unter einer Vielzahl von Chemotherapeutika ist DOX ein allgemeines Mittel zur Behandlung von Brust- und Leberkrebspatientinnen. Die toxische Wirkung von DOX gibt Anlass zur Sorge und schränkt seine Verwendbarkeit ein. Daher wären die Modalitäten zum Erreichen der gewünschten Wirksamkeit und zur Verhinderung einer Hochdosis-Toxizität für dieses Therapieschema von Vorteil.

Die Zellmembran ist der wichtigste Eintrittspunkt für die Medikamente und enthält nanometergroße Mikrodomänen, die mit Cholesterin, Phospholipiden und Sphingolipiden angereichert sind. Cholesterin, ein wesentlicher Partner von Lipidflößen, sorgt für strukturelle Stabilität der Zellmembran. Über einen erhöhten Cholesterinstoffwechsel und dessen Anreicherung wurde in verschiedenen Zellen von Brust-, Prostata- und Mundkrebs berichtet36,37,38. Unter einer Vielzahl aufregender cholesterinabbauender Wirkstoffe ist Methyl-β-Cyclodextrin (MCD) die wirksamste Verbindung, die zum Abbau von Cholesterin aus der Plasmamembran von Zellen verwendet wird39. MCD hat aufgrund seiner sensibilisierenden Wirkung auf verschiedene Chemotherapeutika großes Interesse im Forschungsbereich geweckt. Der Abbau von Membrancholesterin beeinträchtigt die Integrität der Lipidflöße und erhöht die Aufnahme von Ionen und kleinen Nichtelektrolyten.

In der vorliegenden Studie verwendeten wir MCD als Instrument zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit von DOX und unsere Daten legen nahe, dass die Behandlung mit DOX und MCD zusammen den Tod von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wirksam verstärkt. MCD entzieht den Zellen Cholesterin (ergänzende Abbildung 4A-B) und erleichtert dadurch den DOX-induzierten Zelltod als Folge der Erhöhung der intrazellulären DOX-Spiegel. Daher verstärkt MCD den durch DOX verursachten Zelltod, indem es die physiologische Bioverfügbarkeit von DOX im Zellkern erhöht und seinen therapeutischen Index erhöht.

DOX ist ein wirksames DNA-schädigendes Medikament und induziert Apoptose in Krebszellen über zwei unterschiedliche Wege: den membranassoziierten Todesrezeptorweg durch Aktivierung von Caspase-8 und den mitochondrialen Weg durch Aktivierung von Caspase-940. Der membranassoziierte Weg ist der entscheidende molekulare Mechanismus des DOX-induzierten Zelltods, der die Interaktion von FasL mit FasR fördert und dadurch die Bildung des todesinduzierenden Signalkomplexes (DISC) bewirkt, der zur Kaskadenaktivierung verschiedener Caspasen wie Caspase-8, Caspase-3 und Caspase führt -741. Abgesehen von den klassischen apoptotischen Wegen, die durch DOX in Krebszellen induziert werden, kann es auch Apoptose durch eine neue Art von mitotischem Zelltod induzieren, die als Chromosomenfragmentierung bezeichnet wird und während der Metaphase des Zellzyklus in gestressten Zellen auftritt. Dies unterscheidet sich von der typischen Apoptose, unabhängig von Caspasen, und zeigt keine typische internukleosomale Spaltung der DNA, die nicht durch Überexpression von Bcl-242 gehemmt wird. In unserer Studie wurde bei der Behandlung von MCF-7- und Hepa1–6-Zellen mit einer Kombination aus MCD und DOX ein apoptotischer Tod festgestellt und die Zellen schienen unter Stress zu stehen. Die Möglichkeit eines mitotischen Zelltods zusätzlich zur klassischen Apoptose in diesen Zellen kann nicht ausgeschlossen werden. Wir fanden heraus, dass die Behandlung von Zellen mit MCD und DOX zusammen die Sekretion von FasL in das Kulturmedium und die Membranexpression von FasR steigert, was auf eine Wechselwirkung zwischen beiden hinweist. Ein signifikanter Anstieg der Spaltung von Caspase-8, der zu einem Anstieg der Caspase-7-Aktivität und letztendlich zum PARP-Abbau führt, legt nahe, dass MCD die DOX-induzierte Apoptose in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen über einen extrinsischen Weg verstärkt.

Eine Studie von Haupt, S. et al. hat gezeigt, dass das Tumorsuppressorprotein p53 den extrinsischen apoptotischen Weg durch die Induktion von Genen aktiviert, die für verschiedene Membranproteine wie Fas, DR5 und PERP43 kodieren. p53 fungiert als nuklearer Transkriptionsfaktor und reguliert die Expression von Zellzyklusproteinen, blockiert das Fortschreiten der Zellteilung oder induziert Apoptose als Reaktion auf schwere DNA-Schäden44. Es wurde berichtet, dass Wildtyp-p53 kolorektale Karzinomzellen gegenüber 5-Fluorouracil und Topotecan sensibilisiert45. In der vorliegenden Studie führt die gemeinsame Behandlung von Zellen mit DOX und MCD zu starkem Stress, der zu einer Erhöhung des p53-Proteinspiegels und einer Erhöhung seiner Kernlokalisation führt, wodurch die Apoptose in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen gefördert wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass p53 ein entscheidender Faktor für den durch DOX und MCD gemeinsam verursachten Zelltod ist. Mehrere andere Proteine wie FasR und Bax, die durch p53 als Reaktion auf Chemotherapeutika reguliert werden, sind ebenfalls am Zelltod beteiligt. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die p53-Aktivierung FasR hochreguliert, da sein Promotor ein auf p53 reagierendes Element enthält und eine verminderte Expression von p53 mit einer Verringerung des FasR-vermittelten Zelltods verbunden ist46,47,48,49. Studie von Lorenzo, E. et al. hat vorgeschlagen, dass die Behandlung menschlicher primärer Endothelzellen mit DOX die Expression von p53 steigert, das die Expression von FasR50 transkriptionell reguliert. Unsere In-vitro-Ergebnisse legen nahe, dass DOX zusammen mit MCD die nukleare Akkumulation von p53 und die Zelloberflächenexpression von FasR in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen steigerte. Umgekehrt reduzierte die Stummschaltung von p53 durch PFT-α oder durch siRNA die FasR-Expression und verhinderte den Zelltod, was darauf hindeutet, dass FasR das primäre Ziel von p53 ist. Unsere In-vivo-Daten zeigen, dass die Behandlung von DOX zusammen mit MCD das Tumorwachstum im Vergleich zu beiden Wirkstoffen allein deutlich verzögert. Die Quantifizierung von DOX in Tumor- und Lebergewebe konnte DOX nicht nachweisen, mit Ausnahme des Vorliegens einer sehr schwachen Intensität der Ionensignatur im Nierengewebe von Mäusen, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde. Es ist wahrscheinlich, dass entweder der DOX-Spiegel unter der Nachweisschwelle liegt (~ 1 ng/ml) oder dass DOX schnell aus Tumor und lebenswichtigen Organen entfernt wird (ergänzende Abbildung 7). Mäuse, denen MCD zusammen mit DOX verabreicht wurde, zeigten keine Toxizität in den wichtigsten lebenswichtigen Organen und die Überlebensrate dieser Mäuse war im Vergleich zu anderen Gruppen höher. Die Verringerung der Tumorprogression ist hauptsächlich auf die erhöhte Expression des durch p53 regulierten Membranproteins FasR in diesen Mäusen zurückzuführen.

Zusammenfassend zeigt der vorliegende Befund, dass MCD die toxischen Wirkungen von DOX durch den Abbau von Membrancholesterin in MCF-7- und Hepa1–6-Zellen wirksam verstärkt. Die proapoptotische Funktion von DOX zusammen mit MCD beruht auf der Aktivierung des extrinsischen apoptotischen Signalwegs durch p53, was zur Spaltung von Caspasen und schließlich zur Apoptose führt. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Kombination einer niedrigen DOX-Dosis und einer suboptimalen MCD-Dosis als potenzielle Strategie zur Minimierung von Nebenwirkungen dienen und die therapeutische Wirksamkeit von DOX in Brust- und HCC-Zellen verbessern kann.

Methyl-β-Cyclodextrin (MCD), Doxorubicin (DOX), der p53-Inhibitor Pifithrin-α (PFT-α) und Methylthioazol-Tetrazolium (MTT) sowie ein digitaler Messschieber wurden von Sigma-Aldrich (Sigma Aldrich, MO, USA) bezogen. MCD und DOX wurden in Wasser gelöst, um 100 mM bzw. 1 mM Stammlösung herzustellen, und unmittelbar vor der Verwendung im Kulturmedium weiter verdünnt. Der Bestand an PFT-α wurde in DMSO hergestellt. Antikörper gegen p53, MDM2, FasR, FasL, Bax, Bcl-2, PARP, Caspase-8, Caspase-7 und Hsp60 sowie DAPI enthaltendes Eindeckmedium wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) bezogen. Kollagenbeschichtete Kammerobjektträger wurden von MP Biomedicals, CA, USA, gekauft.

MCF-7-Zellen (menschlicher Brustkrebs), Hepa1–6 (Mausleberkrebs) und AML12-Zellen (normale Hepatozyten) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA, USA, erworben und im hauseigenen Cell Repository des National Center aufbewahrt für Zellwissenschaft (NCCS), Pune, Indien. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS (Hyclone, UT, USA), Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) kultiviert inkubiert bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator (Thermo Scientific, NC, USA).

Die Zellen wurden 4 Stunden lang mit MCD vorbehandelt. Anschließend wurden die Zellen mit frischem Medium gewaschen und anschließend 24 Stunden lang mit DOX-haltigem Medium behandelt. In allen Experimenten mit PFT-α wurden die Zellen 4 Stunden lang mit MCD vorbehandelt. Danach wurden die Zellen gewaschen und vor der Zugabe von DOX 1 Stunde lang frisches Medium mit PFT-α (20 μM) zugegeben und während der 24-stündigen Behandlung kontinuierlich dem Inhibitor ausgesetzt.

Zellen (5000/Well) wurden in einer 96-Well-Platte ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen 24 Stunden lang mit unterschiedlicher DOX-Konzentration mit oder ohne MCD oder PFT-α behandelt, wie in der Behandlungsstrategie dargestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT-Assay wie beschrieben gemessen51.

Zellen (5000/Well) wurden in 12-Well-Platten ausplattiert und 24 Stunden lang wachsen gelassen und gemäß Versuchsplan behandelt. Nach 24-stündiger Behandlung wurde das wirkstoffhaltige Medium durch frisches Medium ersetzt und die Zellen konnten 8–10 Tage lang wachsen. Nach Abschluss des Experiments wurden die überlebenden Zellen mit PBS gewaschen und mit 3 % Paraformaldehyd fixiert. Die überlebenden Zellen wurden mit 0,05 % Kristallviolett gefärbt und Bilder der Zellen wurden mit einer Kamera aufgenommen (Olympus, Tokio, Japan).

Zellen (0,3 × 106) wurden in 35-mm-Kulturschalen ausplattiert und wie zuvor beschrieben behandelt. Nach 24-stündiger Behandlung wurde das Medium gesammelt und sekretiertes FasL im Medium durch Sandwich-ELISA wie beschrieben nachgewiesen52.

Zellen (0,3 × 106) wurden in 35-mm-Kulturschalen ausplattiert und wie zuvor beschrieben mit MCD und DOX behandelt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang in PBS mit 2 % Triton X-100 lysiert. Nach der Zentrifugation (12.000 U/min, 15 Min.) wurde der resultierende Überstand wie beschrieben zur Cholesterinbestimmung verwendet27.

Zellen (0,3 × 106) wurden in 35-mm-Kulturschalen ausplattiert und 24 Stunden lang anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie zuvor beschrieben behandelt, gefolgt von der Ernte der Zellen durch Trypsinisierung und der Weiterverarbeitung für die FACS-Analyse zur FasR-Oberflächenfärbung unter Verwendung von FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA). Kurz gesagt, nach der Trypsinisierung wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Diese Zellen wurden 1 Stunde lang mit primärem Antikörper gegen FasR inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und dann 30 Minuten lang mit FITC-konjugiertem sekundärem Antikörper im Dunkeln inkubiert. Durchflusszytometrieanalysen wurden mit dem FACS Calibur-Durchflusszytometer durchgeführt und die Daten wurden mit der CellQuest Pro-Software (BD Biosciences, CA, USA) analysiert.

Zellen (0,3 × 106) wurden in 35-mm-Kulturschalen ausplattiert und 24 Stunden lang anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie zuvor beschrieben behandelt, gefolgt von der Ernte der Zellen durch Trypsinisierung und der Weiterverarbeitung für die FACS-Analyse unter Verwendung von FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA). Kurz gesagt, die Zellen wurden 24 Stunden lang mit DOX mit oder ohne MCD oder PFT-α behandelt, wie in der Behandlungsstrategie beschrieben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und zweimal mit kaltem PBS (pH = 7,4) gewaschen und mit Annexin V-FITC im Bindungspuffer (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,5, enthaltend 140 mM NaCl und 2,5 mM CaCl2) für 10 inkubiert min im Dunkeln bei 37 °C. Die Zellen wurden von FACS Calibur nach 10.000 Ereignissen sortiert, um die Populationen lebender und toter Zellen zu bestimmen. Die Daten wurden mit der CellQuest Pro-Software (BD Biosciences, CA, USA) analysiert.

Zellen (5000/Well) wurden in kollagenbeschichteten Kammerobjektträgern ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie zuvor beschrieben mit MCD und DOX behandelt. Nach Abschluss des Experiments wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 5 Minuten lang mit gekühltem Methanol fixiert. Die Zellen wurden mit DAPI-haltigem Eindeckmedium gefärbt. Zur Visualisierung der intrazellulären Ansammlung von DOX wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSM510, Carl Zeiss, Deutschland) verwendet und es wurden Fotos aufgenommen. Die DOX-Fluoreszenz wurde mit einem Argonlaser bei 488 nm angeregt und die Emission durch einen 550 nm langen Filter gesammelt. Die Aufnahme von DOX in Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 35-mm-Kulturschalen kultiviert und 24 Stunden lang mit MCD, DOX oder PFT-α behandelt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Trypsinisierung geerntet und die Zellsuspension wurde 5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Mindestens 50.000 Ereignisse jeder Probe wurden analysiert, um Histogramme für die Fluoreszenzintensität zu erstellen. Durchflusszytometrieanalysen wurden mit dem FACS Calibur-Durchflusszytometer durchgeführt und die Daten wurden mit der CellQuest Pro-Software (BD Biosciences, CA, USA) analysiert.

Zellen (5000/Well) wurden in kollagenbeschichteten Kammerobjektträgern ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie oben beschrieben mit MCD und DOX behandelt. Nach Abschluss des Experiments wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 5 Minuten lang mit gekühltem Methanol fixiert und dann mit 3 % BSA blockiert und wie zuvor beschrieben für die Immunfluoreszenzanalyse verarbeitet53. Primärantikörper gegen p53 (1:50) wurden hinzugefügt und über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Als nächstes wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierte Sekundärantikörper (1:100) wurden zugegeben und 1 Stunde lang in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde DAPI enthaltendes Eindeckmedium hinzugefügt und die Zellen wurden mit einem konfokalen Mikroskop analysiert und bei 60-facher Vergrößerung fotografiert.

Für das Western-Blotting nach den oben beschriebenen Behandlungen wurden die Zellen dreimal mit gekühltem PBS gewaschen, Ganzzelllysate hergestellt und das Immunblotting wie zuvor beschrieben durchgeführt51.

MCF-7-Zellen (0,3 × 106) wurden in 35-mm-Kulturschalen ausplattiert und mit humanspezifischer p53-siRNA transfiziert, wie von Chhipa et al.53 beschrieben. Die Zellen wurden 24 Stunden lang weiter gezüchtet, gefolgt von der Behandlung mit MCD und DOX wie zuvor beschrieben. Ganzzelllysate wurden wie zuvor beschrieben für das Immunblotting vorbereitet51.

DOX wurde aus Tumor, Leber und Niere von Mäusen extrahiert, denen MCD zusammen mit DOX gemäß der beschriebenen Methode injiziert worden war54. DOX wurde in biologischen Proben mit Agilent 6340 Iontrap (ESI LC-MS, Agilent Technologies, Deutschland) quantifiziert. Alle Daten wurden im positiven Ionisationsmodus mit einem Massenspektrometer erfasst, das im Multiple Reaction Monitoring (MRM) in einem hochauflösenden Modus betrieben wurde, wie beschrieben27.

Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien und nach einem vom Institutional Animal Ethic Committee (IAEC) des NCCS, Pune, Indien, genehmigten Protokoll durchgeführt. Hepa 1–6-Zellen (5 × 106) wurden in 100 μl sterilem PBS resuspendiert und subkutan in die rechte Flanke eines vier bis fünf Wochen alten männlichen C57BL/6J (Gewicht 20 ± 2 g) injiziert, der aus der Versuchstiereinrichtung (EAF) des NCCS erworben wurde . Als Tumore tastbar wurden, wurden tumortragende Mäuse willkürlich in vier Gruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt (n = 6). Gruppe (a), Mäuse, denen Vehikelkontrolle verabreicht wurde, Gruppe (b), Mäuse, denen MCD (64 mg/kg, intraperitoneal) verabreicht wurde, Gruppe (c), Mäuse, denen DOX (1 mg/kg, intraperitoneal) verabreicht wurde, und Gruppe (d), Mäusen wurde gleichzeitig MCD und DOX verabreicht. MCD und DOX wurden in sterilem Wasser gelöst und mit PBS weiter verdünnt und dann Mäusen verabreicht. Die Tumorgrößen wurden jeden zweiten Tag mit einem digitalen Messschieber gemessen. Das Tumorvolumen (mm3) wurde nach der Formel A × B2 × 0,52 (A = Länge; B = Breite; alle Parameter in Millimetern) berechnet. Nach Abschluss des Experiments wurden die Mäuse durch Zervixluxation getötet und die Tumore zur Lysatvorbereitung und zum Immunblotting herausgeschnitten. Für immunhistochemische (IHC) und histopathologische Untersuchungen wurden Tumor- und Organschnitte unmittelbar nach der Exzision in 10 % Paraformaldehyd fixiert.

Feinschnitte (4–5 μm) wurden aus formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Tumoren und Organen hergestellt und auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern fixiert (Safeline Histopathology, Centre, Pune, Indien). Immunhistochemische (IHC) und histopathologische Studien wurden wie zuvor beschrieben26 durchgeführt.

Der TdT-vermittelte dUTP Nick End Labeling (TUNEL)-Assay für Tumorschnitte wurde unter Verwendung von APO-DIRECT (BD Biosciences, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Tumorschnitte wurden 30 Minuten lang mit Proteinase K (10 mg/ml) behandelt. Als nächstes wurden die Tumorschnitte dreimal mit PBS gewaschen und über Nacht in einer Kühlbox mit der TUNEL-Reaktionsmischung gefärbt und dreimal mit PBS gewaschen. Die Objektträger wurden mit DAPI-haltigem Eindeckmedium montiert. Die Objektträger wurden durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht und TUNEL-positive Zellen wurden mit der Image J-Software quantifiziert.

Der statistische Vergleich wurde mit dem zweiseitigen ungepaarten Student-T-Test unter Verwendung der Sigma Plot-Software (Systat Software Inc., CA, USA) durchgeführt. Die Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Quantifizierung der Kolonien erfolgte mit der NIH Image J-Software (Image J Freeware; http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Zitierweise für diesen Artikel: Mohammad, N. et al. Strategie zur Steigerung der Wirksamkeit von Doxorubicin in soliden Tumorzellen durch Methyl-β-Cyclodextrin: Beteiligung von p53 und Fas-Rezeptor-Ligandenkomplex. Wissenschaft. Rep. 5, 11853; doi: 10.1038/srep11853 (2015).

Murray, CJ et al. Globale Krankheitslast 2005: Aufruf zur Zusammenarbeit. Lanzette. 370, 109–110 (2007).

Artikel Google Scholar

Benson, JR & Jatoi, I. Die globale Brustkrebsbelastung. Zukünftige Onkol. 6, 697–702 (2012).

Artikel Google Scholar

Llovet, JM, Burroughs, A. & Bruix, J. Hepatozelluläres Karzinom. Lanzette. 362, 1907–1917 (2003).

Artikel Google Scholar

Beil, DR & Wein, LM Sequenzierungschirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie: Erkenntnisse aus einer mathematischen Analyse. Res und Behandlung von Brustkrebs. 74, 279–286 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Llovet, JM Aktualisierter Behandlungsansatz für hepatozelluläres Karzinom. J Gastroenterol. 40, 225–235 (2005).

Artikel Google Scholar

Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N. & Karliner, JS Doxorubicin-Kardiomyopathie. Kardiologie. 115, 155–162 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Ganey, PE, Carter, LS, Mueller, RA & Thurman, RG Doxorubicin-Toxizität im perfundierten Rattenherz. Verringerter Zelltod bei niedriger Sauerstoffspannung. Zirkelres. 68, 1610–1613 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Gewirtz, DA Eine kritische Bewertung der Wirkmechanismen, die für die Antitumorwirkung der Anthracyclin-Antibiotika Adriamycin und Daunorubicin vorgeschlagen wurden. Biochem Pharmacol. 57, 727–741 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Koceva-Chyla, A., Jedrzejczak, M., Skierski, J., Kania, K. & Jozwiak, Z. Mechanismen der Induktion von Apoptose durch Anthrachinon-Antikrebsmedikamente Clarubicin und Mitoxantron im Vergleich zu Doxorubicin: Zusammenhang mit Arzneimittelzytotoxizität und Caspase -3 Aktivierung. Apoptose. 10, 1497–1514 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Suzuki, F. et al. Induktion tumorspezifischer Zytotoxizität und Apoptose durch Doxorubicin. Anti-Krebs-Res. 25, 887–893 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Wang, S. et al. Doxorubicin induziert Apoptose in normalen Zellen und Tumorzellen über deutlich unterschiedliche Mechanismen. Vermittlung von H(2)O(2)- und p53-abhängigen Signalwegen. J Biol. Chem. 279, 25535–25543 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., Cairo, G. & Gianni, L. Anthracycline: molekulare Fortschritte und pharmakologische Entwicklungen in der Antitumoraktivität und Kardiotoxizität. Pharmacol Rev. 56, 185–229 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Miyashita, T. et al. Der Tumorsuppressor p53 ist ein Regulator der bcl-2- und bax-Genexpression in vitro und in vivo. Onkogen. 9, 1799–1805 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Marine, JC Pharmakologische Rettung von p53 in der Krebstherapie: Erweiterung des empfindlichen Tumorspektrums durch gezielte Behandlung von MDMX. Krebszelle. 18, 399–400 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Harris, SL & Levine, AJ Der p53-Weg: positive und negative Rückkopplungsschleifen. Onkogen. 24, 2899–2908 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Chiarini, F. et al. Eine Kombination von Temsirolimus, einem allosterischen mTOR-Inhibitor, mit Clofarabin als neue Therapieoption für Patienten mit akuter myeloischer Leukämie. Oncotarget. 3, 1615–1628 (2012).

Artikel Google Scholar

Casanova, F. et al. Resveratrol chemosensibilisiert Brustkrebszellen durch Zellzyklusstopp für Melphalan. J Cell Biochem. 113, 2586–2596 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Qian, H., Yang, Y. & Wang, Eur J Pharm Sci. 43, 125–131 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Yuan, XW et al. Interferon-alpha erhöht die Empfindlichkeit menschlicher Osteosarkom-U2OS-Zellen gegenüber Doxorubicin durch p53-abhängige Apoptose. Acta Pharmacologica Sinica. 28, 1835–1841 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, G., Zhang, J., Liu, L., Sharma, S. & Dong, Q. Quercetin verstärkt Doxorubicin-vermittelte Antitumorwirkungen gegen Leberkrebs durch p53/Bcl-xl. PLoS One 7, e51764 (2012).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Fan, C. et al. Strategie zur Verstärkung der therapeutischen Wirkung von Doxorubicin beim menschlichen hepatozellulären Karzinom durch Selenocystin, einem synergistischen Wirkstoff, der die ROS-vermittelte Signalübertragung reguliert. Oncotarget. 5, 2853–2863 (2014).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. et al. Ocotillol verstärkte die Antitumoraktivität von Doxorubicin durch p53-abhängige Apoptose. Evid Based Complement Alternat Med. 2013, 468537 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Kilsdonk, EP et al. Durch Cyclodextrine vermittelter zellulärer Cholesterinausfluss. J Biol. Chem. 270, 17250–17256 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Frijlink, HW et al. Die Pharmakokinetik von Beta-Cyclodextrin und Hydroxypropyl-Betacyclodextrin bei der Ratte. Pharm Res. 7, 1248–1252 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Irie, T., Fukunaga, K. & Pitha, J. Hydroxypropylcyclodextrine in parenteraler Anwendung. I: Lipidauflösung und Auswirkungen auf Lipidtransfers in vitro. J Pharm Sci. 81, 521–523 (1992).

Artikel CAS Google Scholar

Upadhyay, AK et al. Methyl-β-Cyclodextrin erhöht die Anfälligkeit menschlicher Brustkrebszellen gegenüber Carboplatin und 5-Fluorouracil: Beteiligung von Akt, NF-κB und Bcl-2. Toxicol Appl Pharmacol. 216, 177–185 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Mohammad, N. et al. Der Cholesterinabbau durch Methyl-β-Cyclodextrin verstärkt den durch Tamoxifen verursachten Zelltod, indem es seine Aufnahme bei Melanomen erhöht. Maulwurfskrebs. 13, 204 (2014).

Artikel Google Scholar

Onodera, R., Motoyama, K., Okamatsu, A., Higashi, T. & Arima, H. Mögliche Verwendung von Folat-angehängtem Methyl-b-Cyclodextrin als Antikrebsmittel. Sci Rep. 3, 1104 (2013).

Artikel ADS Google Scholar

Rocks, N. et al. Curcumin-Cyclodextrin-Komplexe verstärken die Wirkung von Gemcitabin in einem orthotopischen Mausmodell für Lungenkrebs. Br J Krebs. 107, 1083–1092 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Zheng, C., Qiu, L., Yao, X. & Zhu, K. Neuartige Mizellen aus Pfropfpolyphosphazenen als potenzielle Arzneimittelabgabesysteme gegen Krebs: Arzneimittelverkapselung und In-vitro-Bewertung. Int J Pharm. 373, 133–140 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Velez, JM et al. p53 reguliert die durch oxidativen Stress vermittelte retrograde Signalübertragung: ein neuartiger Mechanismus für durch Chemotherapie verursachte Herzschäden. Plus eins. 30, e18005 (2011)

Artikel Google Scholar

Sheard, MA, Vojtesek, B., Janakova, L., Kovarik, J. & Zaloudik, J. Hochregulierung von Fas (CD95) in menschlichen p53-Wildtyp-Krebszellen, die mit ionisierender Strahlung behandelt wurden. Int J Krebs. 73, 757–762 (1997).

3.0.CO;2-1" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0215%2819971127%2973%3A5%3C757%3A%3AAID-IJC24%3E3.0.CO%3B2-1" aria-label="Article reference 32" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0215(19971127)73:53.0.CO;2-1">Artikel CAS Google Scholar

Müller, M. et al. Die medikamenteninduzierte Apoptose in Hepatomzellen wird durch das CD95 (APO-1/Fas)-Rezeptor/Liganden-System vermittelt und beinhaltet die Aktivierung von Wildtyp-p53. J Clin Invest. 99, 403–413 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Ruiz-Ruiz, C., Robledo, G., Cano, E., Redondo, JM & Lopez-Rivas, A. Charakterisierung der p53-vermittelten Hochregulierung der CD95-Genexpression nach genotoxischer Behandlung in menschlichen Brusttumorzellen. J Biol. Chem. 278, 31667–31675 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Bennett, M. et al. Zelloberflächentransport von Fas: ein schneller Mechanismus der p53-vermittelten Apoptose. Wissenschaft. 282, 290–293 (1998).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Duncan, RE, El-Sohemy, A. & Archer, MC Mevalonat fördert das Wachstum von Tumoren, die aus menschlichen Krebszellen stammen, in vivo und stimuliert die Proliferation in vitro mit erhöhter Cyclin-abhängiger Kinase-2-Aktivität. J Biol. Chem. 279, 33079–33084 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Vizio, D., Solomon, KR & Freeman, MR Cholesterin und cholesterinreiche Membranen bei Prostatakrebs: ein Update. Tumor. 9, 4633–639 (2008).

Google Scholar

Kolanjiappan, K., Ramachandran, CR & Manoharan, S. Biochemische Veränderungen im Tumorgewebe von Mundkrebspatienten. Klinik Biochem. 36, 61–65 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Pitha, J., Irie, T., Sklar, PB & Nye, JS Arzneimittellösungsvermittler zur Unterstützung von Pharmakologen: amorphe Cyclodextrin-Derivate. Lebenswissenschaft. 43, 493–502 (1998).

Artikel Google Scholar

Grün, DR Apoptotische Wege: Papier umhüllt Stein, stumpft Schere ab. Zelle. 102, 1–4 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Ashkenazi, A. & Dixit, VM Todesrezeptoren: Signalisierung und Modulation. Wissenschaft. 281, 1305–1308 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Stevens, JB et al. Mitotischer Zelltod durch Chromosomenfragmentierung. Krebs Res. 67, 7686–7694 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Haupt, S., Berger, M., Goldberg, Z. & Haupt, Y. Apoptose – das p53-Netzwerk. J Cell Sci. 116, 4077–4085 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Roos, WP & Kaina, B. DNA-Schaden-induzierte Apoptose: Von spezifischen DNA-Läsionen bis zur DNA-Schadensreaktion und Apoptose. Krebs Lett. 332, 237–248 (2012).

Artikel Google Scholar

Yang, B., Eshleman, JR, Berger, NA & Markowitz, SD Wildtyp-p53-Protein verstärkt die Zytotoxizität von Therapeutika in menschlichen Darmkrebszellen. Clin Cancer Res. 2, 1649–1657 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Friesen, C., Herr, I., Krammer, PH & Debatin, KM Beteiligung des CD95 (APO-1/FAS)-Rezeptor/Liganden-Systems an der medikamenteninduzierten Apoptose in Leukämiezellen. Nat Med. 2, 574–577 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Shinoura, N., Yoshida, Y., Asai, A., Kirino, T. & Hamada, H. Der durch Adenovirus vermittelte Transfer von p53 und dem Fas-Liganden steigert die Apoptose bei Gliomen drastisch. Krebsgen-Ther. 7, 732–738 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Munsch, D. et al. Die Fas-Todesrezeptorgene von Mensch und Maus (APO-1/CD95) enthalten jeweils ein p53-responsives Element, das durch p53-Mutanten aktiviert wird, die nicht in der Lage sind, Apoptose auszulösen. J Biol. Chem. 275, 3867–3872 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Egle, A. et al. Expression von Apo-1/Fas (CD95), Bcl-2, Bax und Bcl-x in Myelomzelllinien: Zusammenhang zwischen der Reaktion auf Anti-Fas-mab und dem Funktionsstatus von p53. Br J Hämatol. 97, 418–428 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Lorenzo, E. et al. Doxorubicin induziert Apoptose und CD95-Genexpression in menschlichen primären Endothelzellen über einen p53-abhängigen Mechanismus. J Biol. Chem. 277, 10883–10892 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Pandey, V., Vijayakumar, MV, Ajay, AK, Malvi, P. & Bhat, MK Diätinduzierte Fettleibigkeit erhöht das Fortschreiten des Melanoms: Beteiligung von Cav1 und FASN. Int J Krebs. 130, 497–508 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Kumari, R., Sharma, A., Ajay, AK & Bhat, MK Mitomycin C induziert die Tötung von Zuschauern in homogenen und heterogenen Hepatom-Zellmodellen. Maulwurfskrebs. 8, 87 (2009).

Artikel Google Scholar

Chhipa, RR, Kumari, R., Upadhyay, AK & Bhat, MK Die Aufhebung von p53 durch sein Antisense in MCF-7-Brustkarzinomzellen erhöht Cyclin D1 über die Aktivierung von Akt und die Förderung der Zellproliferation. Exp. Zellres. 313, 3945–3958 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Kesavan, SK et al. Proteomweite Reduktion der AGE-Modifikation bei Streptozotocin-induzierten diabetischen Mäusen durch Hydralazin-vermittelte Transglykation. Sci Rep. 3, 2941 (2013).

Artikel Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. SC Mande, Direktor, NCCS, Pune, Indien, und Dr. GC Mishra, ehemaliger Direktor, NCCS, Pune, Indien für ihre große Unterstützung und jede Ermutigung zur Durchführung dieser Arbeit. NM und BC danken dem Council for Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien; SVS und PM danken der University Grants Commission (UGC), Neu-Delhi, Indien; DA dankt dem Department of Biotechnology (DBT), Indien, für das Forschungsstipendium. Die Unterstützung durch die Experimental Animal Facility (EAF), die Central Instrumental Facility und das technische Personal des NCCS wird ebenfalls gebührend gewürdigt. Die Autoren danken außerdem dem Amrita Agilent Analytical Research Centre, der Amrita School of Biotechnology, der Amrita Vishwa Vidyapeetham University, Kollam, Indien, für massenspektrometrische Daten und Frau Revathy MR für ihre Hilfe bei der Sammlung von MS-Daten. Finanzielle Unterstützung: Diese Arbeit wurde durch ein internes Stipendium des NCCS unterstützt, das vom Ministerium für Biotechnologie der indischen Regierung finanziert wurde. Hinweis: Diese Arbeit wurde im Rahmen der Erfüllung des Ph.D. durchgeführt. Dissertation über NM soll an der Savitribai Phule Pune University, Pune, Indien, eingereicht werden. Diese Arbeit wurde teilweise auf der fünften internationalen Konferenz der Carcinogenesis Foundation (USA) vom 11. bis 13. Februar 2015 in Mumbai vorgestellt.

Nationales Zentrum für Zellwissenschaft, Campus der Universität Pune, Ganeshkhind, 411007, Pune, Indien

Naoshad Mohammad, Shivendra Vikram Singh, Parmanand Malvi, Balkrishna Chaube, Dipti Athavale und Manoj Kumar Bhat

Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham University, Kollam, 690525, Indien

Muralidharan Vanuopadath, Sudarslal Sadasivan Nair und Bipin Nair

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeption und Design der Experimente: MKB und NM. Durchführung der Experimente: NM, SVS, PM, BC und DA. Durchführung der Massenspektrometrie-Experimente: MV, SSN und BN. Analyse der Daten: NM und MKB. Verfassen des Artikels: NM und MKB. Alle Autoren überprüft das Manuskript.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Mohammad, N., Vikram Singh, S., Malvi, P. et al. Strategie zur Steigerung der Wirksamkeit von Doxorubicin in soliden Tumorzellen durch Methyl-β-Cyclodextrin: Beteiligung von p53 und Fas-Rezeptor-Ligandenkomplex. Sci Rep 5, 11853 (2015). https://doi.org/10.1038/srep11853

Zitat herunterladen

Eingegangen: 30. März 2015

Angenommen: 20. Mai 2015

Veröffentlicht: 7. Juli 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep11853

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2022)

Wissenschaftliche Berichte (2022)

Cancer Cell International (2021)

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.