Glukokortikoide erhöhen den Schutz der Gewebezellen vor Poren

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 186 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Viele Arten pathogener Bakterien schädigen Gewebezellen, indem sie Toxine absondern, die Poren in Plasmamembranen bilden. Hier zeigen wir, dass Glukokortikoide den Eigenschutz von Gewebezellen vor porenbildenden Toxinen erhöhen. Dexamethason schützte mehrere Zelltypen vor dem cholesterinabhängigen Cytolysin Pyolysin aus Trueperella pyogenes. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte den durch Pyolysin verursachten Austritt von Kalium und Laktatdehydrogenase, begrenzte Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts, reduzierte die Bildung von Plasmamembranen und verhinderte die Zytolyse. Hydrocortison und Fluticason schützten auch vor Pyolysin-induzierten Zellschäden. Darüber hinaus schützte Dexamethason HeLa- und A549-Zellen vor den porenbildenden Toxinen Streptolysin O aus Streptococcus pyogenes und Alpha-Hämolysin aus Staphylococcus aureus. Der Zytoprotektionsschutz durch Dexamethason war nicht mit Veränderungen des zellulären Cholesterins oder der Aktivierung von Zellstressreaktionen der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) verbunden. Allerdings war die Zytoprotektion vom Glukokortikoidrezeptor und der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR) abhängig. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Glukokortikoide genutzt werden könnten, um Gewebeschäden zu begrenzen, die durch Krankheitserreger verursacht werden, die porenbildende Toxine absondern.

Viele Arten pathogener Bakterien scheiden Toxine aus, die Poren in der Plasmamembran eukaryontischer Zellen bilden1,2. Diese porenbildenden Toxine verursachen Zellschäden und Zytolyse, was zur Virulenz der Bakterien und zur Entstehung von Krankheiten beiträgt. Allerdings verringert die Behandlung mit Glukokortikoiden die Schwere einiger bakterieller Erkrankungen3,4,5. Wir gehen davon aus, dass diese positiven Wirkungen teilweise darauf zurückzuführen sind, dass Glukokortikoide Entzündungen und Immunpathologien hemmen6. Hier haben wir untersucht, ob Glukokortikoide auch dazu beitragen können, dass sich Gewebezellen vor Schäden durch porenbildende Toxine schützen.

Porenbildende Toxine ermöglichen die Zufuhr bakterieller Virulenzfaktoren in eukaryontische Zellen, führen zum Austritt zytosolischer Moleküle, die Bakterien als Nährstoffe nutzen, und erleichtern die bakterielle Invasion1,2. Zu den Krankheitserregern, die porenbildende Toxine absondern, gehören Trueperella pyogenes, das bei Nutztieren eitrige Infektionen verursacht, Streptococcus pyogenes, das bei Kindern Pharyngitis und Impetigo verursacht, und Staphylococcus aureus, das bei Tieren und Menschen Lungenentzündung, Sepsis und Hautinfektionen verursacht2,7, 8,9,10. Trueperella pyogenes und Streptococcus pyogenes produzieren Pyolysin bzw. Streptolysin O, die zur häufigsten Familie porenbildender Toxine, den cholesterinabhängigen Cytolysinen, gehören. Cholesterinabhängige Cytolysine binden Plasmamembrancholesterin und bilden dann Membranporen11,12. Pyolysinmoleküle bilden β-Barrel-Transmembranporen mit einem Innendurchmesser von 18 nm und Streptolysinmoleküle bilden Poren mit einem Innendurchmesser von 26 nm9,13,14. Diese Poren führen zum Kaliumausfluss aus den Zellen, zum Kalziumeinstrom, zum Austritt von zytosolischen Proteinen wie Laktatdehydrogenase (LDH), zu Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts und zur Zytolyse15,16,17. Staphylococcus aureus sondert ein α-Hämolysin ab, das an Plasmamembranen bindet, wo 7 Moleküle oligomerisieren und eine β-Fass-Transmembranpore mit einem Innendurchmesser von 1,4 nm bilden, was ebenfalls zum Austreten von zytosolischen Molekülen und zur Zytolyse führt7,18,19. Die Verhinderung oder Verringerung der Schwere einer Krankheit hängt davon ab, dass das Immunsystem pathogene Bakterien abtötet und entfernt und dass die durch die Krankheitserreger verursachten Gewebeschäden und die Immunantwort begrenzt werden20. Obwohl Zellen die durch porenbildende Toxine verursachten Schäden reparieren können15,21,22,23, ist wenig über den intrinsischen Schutz der Zellen vor diesen Toxinen bekannt.

Glukokortikoide werden ausgeschüttet, um die Stoffwechselanpassung zu fördern, Entzündungen zu hemmen und die Gewebereparatur zu unterstützen, als Teil der Stressreaktion auf eine Infektion6,24,25. Glukokortikoide binden an den weit verbreiteten Glukokortikoidrezeptor (GR; kodiert durch NR3C1), was zur Unterdrückung des Transkriptionsfaktors, zur Genregulation und zu nichtgenomischen Effekten führt24,25,26,27. Die pleiotropen Wirkungen von Glukokortikoiden sind häufig zelltyp- und kontextspezifisch und umfassen die Einschränkung der angeborenen Immunität, die Hemmung von Stressreaktionen der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK), die Unterdrückung der Produktion von Entzündungsmediatoren und die Veränderung des Zellstoffwechsels24,25,26,27. Glukokortikoide wie Dexamethason, Hydrocortison und Fluticason werden als entzündungshemmende Medikamente eingesetzt, um die mit bakteriellen Infektionen verbundenen Entzündungen und Immunpathologien zu begrenzen6,24,25,28. Wir vermuten jedoch, dass Glukokortikoide auch den Eigenschutz von Gewebezellen vor Schäden durch Krankheitserreger stimulieren können. Wenn Glukokortikoide den Schutz von Gewebezellen vor porenbildenden Toxinen erhöhen können, hätte dies wichtige Auswirkungen auf den Nutzen von Steroidbehandlungen zur Vorbeugung oder Begrenzung der durch Infektionen mit pathogenen Bakterien verursachten Pathologie.

Hier haben wir die Hypothese getestet, dass Glukokortikoide Gewebezellen dabei helfen, sich vor Schäden durch porenbildende Toxine zu schützen. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit Dexamethason, Hydrocortison oder Fluticason mehrere Zelltypen vor Schäden durch cholesterinabhängige Cytolysine oder α-Hämolysin schützte. Glukokortikoide erhöhten den intrinsischen Schutz der Zellen und der Zytoprotektion hing vom Glukokortikoidrezeptor und dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der Cholesterinbiosynthese, der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR), ab. Dieser bisher nicht erkannte Glukokortikoid-Zytoprotektionsschutz ergänzt die etablierte Rolle von Glukokortikoiden bei der Begrenzung der Schwere bakterieller Erkrankungen durch die Unterdrückung von Entzündungen und Immunpathologien.

Pyolysin ist für die Untersuchung des Zytoprotektionsschutzes nützlich, da es Poren in der Plasmamembran vieler Arten eukaryontischer Zellen bildet8,10. Darüber hinaus erfordert Pyolysin im Gegensatz zu den meisten cholesterinabhängigen Cytolysinen in vitro keine chemische Aktivierung mit Reduktionsmitteln. Wir haben HeLa-Zellen verwendet, da diese Epithelzellen des Gebärmutterhalses häufig zur Erforschung zellulärer Reaktionen auf Cytolysine15,16,21,29 verwendet werden. Um eine geeignete Pyolysin-Herausforderung für die Erforschung des Zytoprotektionsschutzes zu ermitteln, haben wir zunächst Zellen in 24-Well-Platten in serumfreiem Medium 24 Stunden lang kultiviert und sie dann 2 Stunden lang mit verschiedenen Mengen Pyolysin herausgefordert. Es wurde serumfreies Medium verwendet, um störende Auswirkungen von Serumcholesterin, kortikosteroidbindendem Globulin und der Aktivierung von Zellsignalwegen zu vermeiden30. Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Pyolysin belastet, da dies ausreichend Zeit ist, um Zellschäden zu verursachen10,31 und weil längere Belastungen auch Reparatur oder Zellreplikation widerspiegeln könnten. Die Pyolysin-Exposition führte zum Austreten von LDH in die Zellüberstände und zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen, wie durch MTT-Assays bestimmt (Abb. 1a). Die Pyolysin-Belastung führte auch zum Verlust von intrazellulärem Kalium (Abb. 1b), veränderte das Aktin-Zytoskelett und die Zellform (obere Felder, Abb. 1 c, ergänzende Abb. 1a – c) und induzierte Blasenbildung in der Plasmamembran (ergänzende Abb. 1d). Wir haben 100 HU/Well-Pyolysin für Zytoprotektionsexperimente ausgewählt, da dies eine Zytolyse von > 80 % verursachte.

a HeLa-Zellen wurden mit Pyolysin belastet und das Austreten von LDH in die Überstände gemessen und die Lebensfähigkeit der Zellen durch MTT-Assay nach 2 Stunden bestimmt, oder b intrazelluläres Kalium nach 5 Minuten gemessen. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA bestimmt. c Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Zellen, die 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, dann 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin behandelt und mit fluoreszierendem Phalloidin (weiß) und DAPI (rot) gefärbt wurden, wobei die Bilder repräsentativ für 4 sind unabhängige Experimente. d Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und die LDH-Leckage und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt und P-Werte für den Behandlungseffekt auf die Pyolysin-Provokation angegeben. e Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 5 Minuten lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und das intrazelluläre Kalium quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Dunnett bestimmt. f Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Pyolysin behandelt und der LDH-Austritt sowie die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten stammen aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt. Linien repräsentieren Mittelwerte. g Zellen wurden für die angegebene Zeit mit 10 µM Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Bei den Pyolysin-Daten handelt es sich um Prozentsätze der Kontrollbelastung, wobei die Punkte einzelne Werte aus drei unabhängigen Experimenten darstellen. Die Linie entspricht der Methode der kleinsten Quadrate. h Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, für die angegebenen Zeiten mit Kontrolle oder 100 HE/Vertiefung Pyolysin herausgefordert und die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt. Pyolysin-Daten sind Prozentsätze der Kontrollbelastung aus 4 unabhängigen Experimenten; Linien repräsentieren Mittelwerte.

Wir untersuchten, ob die 24-stündige Behandlung von HeLa-Zellen mit Dexamethason sie vor einer anschließenden 2-stündigen Pyolysin-Exposition ohne weitere Dexamethason-Behandlung schützte. Dexamethason reduzierte den durch Pyolysin verursachten LDH-Austritt und die Zytolyse (Abb. 1d). Bereits 0,01 µM Dexamethason reduzierten sowohl den LDH-Austritt als auch die Zytolyse (P < 0,001), und 10 µM Dexamethason reduzierten den LDH-Austritt um 84 % und die Zytolyse von 83 % auf 9 %. Die Behandlung mit 10 µM Dexamethason begrenzte auch Pyolysin-induzierte Veränderungen der Zellform und des Aktin-Zytoskeletts (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1a–c; 28 ± 2 % vs. 88 ± 2 % Zellen geschädigt; n = 3 unabhängige Experimente, Chi-Quadrat). , P < 0,01) und reduzierte Pyolysin-induzierte Blasenbildung der Plasmamembran (Tabelle 1). Die Behandlung mit 10 µM Dexamethason reduzierte auch den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 5-minütigen Pyolysin-Exposition (Abb. 1e).

Dexamethason war gegen 50 bis 200 HU/Well Pyolysin wirksam (Abb. 1f), und Zytoprotektion war offensichtlich, wenn HeLa-Zellen ≥ 6 Stunden lang mit Dexamethason behandelt wurden (Abb. 1g). Darüber hinaus schützte die 24-stündige Behandlung mit 10 µM Dexamethason die Zellen vor Pyolysin-Belastungen, die zwischen 1 und 24 Stunden anhielten (Abb. 1h). Zusammengenommen liefern diese Daten Belege für den Zellschutz von HeLa-Zellen gegen Pyolysin durch Dexamethason.

Um zu untersuchen, ob der Zytoschutz von Dexamethason gegen Pyolysin über HeLa-Zellen hinausgeht, verwendeten wir A549-Lungenepithelzellen, da diese auch häufig zur Untersuchung von Reaktionen auf Zytolysine verwendet werden19,32. Das Herausfordern von A549-Zellen mit ≥ 25 HU/Well-Pyolysin für 2 Stunden führte zu einem LDH-Austritt und einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen (ANOVA, P <0,001, ergänzende Abbildung 2a). Die 24-stündige Behandlung von A549-Zellen mit Dexamethason verringerte jedoch den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer 2-stündigen Belastung mit 25 HU/Well-Pyolysin (Abb. 2a) und verringerte den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 5-minütigen Belastung (Abb. 2b). Die Behandlung mit 10 µM Dexamethason reduzierte auch Pyolysin-induzierte Veränderungen der Zellform und des Aktin-Zytoskeletts (Abb. 2c; 7 ± 4 vs. 71 ± 5 % der Zellen geschädigt, n = 3 unabhängige Experimente, Chi-Quadrat, P < 0,01). Der Dexamethason-Zytoprotektionsschutz war gegen 12,5 bis 100 HU/Well-Pyolysin wirksam (Abb. 2d).

a A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 25 HU/Well-Pyolysin in Kontakt gebracht und die LDH-Leckage und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt und P-Werte für den Behandlungseffekt auf die Pyolysin-Provokation angegeben. b A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 5 Minuten lang mit Kontroll- oder 25 HU/Well-Pyolysin belastet und das intrazelluläre Kalium quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Dunnett bestimmt. c Fluoreszenzmikroskopische Bilder von A549-Zellen, die 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 25 HU/Well-Pyolysin behandelt und mit fluoreszierendem Phalloidin (weiß) und DAPI (rot) gefärbt wurden; Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. d A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit Pyolysin behandelt und die LDH-Leckage und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt. e Hep-G2-Zellen, NCI-H441-Zellen und dermale Fibroblasten wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt und 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin belastet (Hep-G2, 100 HU/Well; NC1-H441, 200 HU/ Well; primäre menschliche dermale Fibroblasten, 25 HU/Well) und LDH-Leckage gemessen und Zelllebensfähigkeit durch MTT-Assay oder CYQUANT (Fibroblasten) quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Bonferroni bestimmt. f Menschliche Lungenfibroblasten, PNT2-Zellen, Met5A-Zellen oder primäre menschliche Chondrozytenzellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, 2 Stunden lang mit den angegebenen Mengen Pyolysin belastet und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus 3 oder 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt.

Wir haben auch den Zytoprotektionsschutz von Dexamethason gegen Pyolysin an weiteren sieben verschiedenen Arten menschlicher Zellen getestet. Nach einer 2-stündigen Belastung mit 100 HU/Well Pyolysin in Hep-G2-Leberzellen, 200 HU/Well Pyolysin in NC1-H441-Lungenepithelzellen und 25 HU/Well Pyolysin in primären normalen dermalen Fibroblasten war ein Austreten von LDH und Zytolyse offensichtlich ( Ergänzende Abbildung 2b–d). Allerdings verringerte die 24-stündige Behandlung mit 10 µM Dexamethason den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer 2-stündigen Pyolysin-Exposition in Hep-G2-Zellen, NCI-H441-Zellen und dermalen Fibroblasten (Abb. 2e). Die 24-stündige Behandlung mit 10 µM Dexamethason reduzierte auch die Zytolyse nach einer 2-stündigen Exposition mit verschiedenen Pyolysinmengen in primären normalen menschlichen Lungenfibroblasten und in PNT2 SV40 transformierten normalen Prostataepithelzellen, allerdings nicht in Met5A SV40 transformierten normalen Mesothelzellen oder primären menschliche Chondrozyten (Abb. 2f). Schließlich reduzierte die 24-stündige Behandlung mit 100 µM Dexamethason die Zytolyse nach einer 2-stündigen Belastung mit 200 HU Pyolysin in primären bovinen Endometriumepithelzellen (Dexamethason 48,2 ± 7,8 % gegenüber Vehikel 82,8 ± 1,2 Zytolyse, P = 0,015, n = 4 unabhängige Experimente). .

Wir untersuchten, ob andere Glukokortikoide als Dexamethason Zellen vor Pyolysin schützen können. Die 24-stündige Behandlung von HeLa-Zellen mit Hydrocortison reduzierte den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer 2-stündigen Pyolysin-Provokation (Abb. 3a) und reduzierte den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 5-minütigen Provokation (Abb. 3b). Darüber hinaus reduzierte 10 µM Hydrocortison Pyolysin-induzierte Veränderungen der HeLa-Zellform und des Aktin-Zytoskeletts (32 ± 9 % gegenüber 88 ± 2 % geschädigten Zellen; n = 3 unabhängige Experimente, Chi-Quadrat, P < 0,01) und reduzierte Pyolysin- induzierte Blasenbildung in der Plasmamembran (Tabelle 1). Der Zytoschutz war offensichtlich, wenn die Zellen ≥ 6 Stunden lang mit Hydrocortison behandelt wurden (ergänzende Abbildung 3a). Die Behandlung von HeLa-Zellen mit dem selektiven Glukokortikoidrezeptor-Agonisten Fluticasonpropionat28 reduzierte auch den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer zweistündigen Pyolysin-Exposition (Abb. 3c).

a-HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder Hydrocortison behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und die LDH-Leckage und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt und P-Werte für den Behandlungseffekt auf die Pyolysin-Provokation angegeben. b HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Hydrocortison behandelt, 5 Minuten lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und das intrazelluläre Kalium quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Dunnett bestimmt. c HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder Fluticasonpropionat behandelt, 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin in Kontakt gebracht und die LDH-Leckage und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA bestimmt und P-Werte für den Behandlungseffekt auf die Pyolysin-Provokation angegeben. d–f Die Experimente a–c wurden jeweils unter Verwendung von A549-Zellen wiederholt, die mit 25 HU/Well Pyolysin behandelt wurden.

Die 24-stündige Behandlung von A549-Zellen mit Hydrocortison reduzierte den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer 2-stündigen Pyolysin-Exposition (Abb. 3d); und neigte dazu, den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 5-minütigen Belastung zu verringern (Abb. 3e). Darüber hinaus reduzierten 10 µM Hydrocortison Pyolysin-induzierte Veränderungen der A549-Zellform und des Aktin-Zytoskeletts (16 ± 4 vs. 71 ± 5 % beschädigte Zellen, n = 3 unabhängige Experimente, Chi-Quadrat, P < 0,01). Fluticason reduzierte auch den Pyolysin-induzierten LDH-Austritt und die Zytolyse in A549-Zellen (Abb. 3f).

Als nächstes untersuchten wir mithilfe von Streptolysin O und Staph, ob Dexamethason Zellen vor anderen porenbildenden Toxinen als Pyolysin schützen kann. aureus α-Hämolysin. Die Belastung von HeLa- oder A549-Zellen mit Streptolysin O führte nach einer zweistündigen Belastung zu LDH-Austritt und Zytolyse (ergänzende Abbildung 4a, b). Die 24-stündige Behandlung von HeLa-Zellen oder A549-Zellen mit 10 µM Dexamethason verringerte jedoch den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer 2-stündigen Streptolysin-O-Exposition und verringerte den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 5-minütigen Exposition (Abb. 4a, b). Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte auch den LDH-Austritt und die Zytolyse nach zweistündiger Belastung mit verschiedenen Konzentrationen von Streptolysin O (ergänzende Abbildung 4a, b).

a, b HeLa-Zellen bzw. A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, mit Kontrolle oder Streptolysin O (HeLa, 12,5 µg/Well; A549, 6,25 µg/Well) und LDH-Leckage und Zelle herausgefordert Lebensfähigkeit nach 2 Stunden quantifiziert oder intrazelluläres Kalium nach 5 Minuten gemessen. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 3 oder 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Šídák bestimmt. c, d HeLa-Zellen bzw. A549-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt, mit Kontrolle oder 8 µg/Vertiefung α-Hämolysin belastet und LDH-Austritt und Zelllebensfähigkeit nach 24 Stunden quantifiziert oder zelluläres Kalium danach gemessen 15 Minuten. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 3 oder 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Šídák bestimmt.

Die Belastung von HeLa- oder A549-Zellen mit 8 µg/Well α-Hämolysin führte nach 24 Stunden zu LDH-Austritt und Zytolyse (ergänzende Abbildung 4c, d). Die 24-stündige Behandlung von HeLa-Zellen mit Dexamethason verringerte jedoch den LDH-Austritt und die Zytolyse nach einer anschließenden 24-stündigen α-Hämolysin-Exposition und verringerte den Verlust von intrazellulärem Kalium nach einer 15-minütigen Exposition (Abb. 4c, ergänzende Abb. 4e). Die Behandlung von A549-Zellen mit Dexamethason verringerte ebenfalls die durch α-Hämolysin induzierte LDH-Leckage, veränderte jedoch die Zytolyse oder den Verlust von intrazellulärem Kalium nicht wesentlich (Abb. 4d, ergänzende Abb. 4f). Dexamethason verhinderte durch α-Hämolysin induzierte Veränderungen der Form und des Zytoskeletts von HeLa-Zellen (ergänzende Abbildung 4g, 17 ± 4 vs. 86 ± 3 % Zellen beschädigt, Chi-Quadrat, n = 3 unabhängige Experimente, P <0,01), jedoch nicht A549 Zellen (Ergänzende Abbildung 4h, 89 ± 2 vs. 76 ± 6 % Zellen beschädigt). Zusammengenommen ergeben die Daten in Abb. 1–4 liefern Belege dafür, dass eukaryontische Gewebezellen durch Glukokortikoide gegen porenbildende Toxine geschützt werden, und insbesondere dafür, dass Dexamethason den zelleigenen Schutz gegen Pyolysin erhöht.

Porenbildende Toxine, darunter Pyolysin, Streptolysin O und α-Hämolysin, aktivieren die Stressreaktion der MAPK-Zellen nach Kaliumausfluss oder Kalziumeinstrom15,29,33,34,35. Daher sind die Verstärkung der MAPK-Aktivierung, der zelluläre Kaliumausfluss oder der Kalziumeinstrom potenzielle Mechanismen zum Schutz der Zellen vor Cytolysinen. Dexamethason oder Hydrocortison stimulierten jedoch nicht die ERK1/2-, p38- oder JNK-Phosphorylierung in HeLa-Zellen (Abb. 5). Stattdessen verhinderte die Glukokortikoid-Behandlung die Pyolysin-induzierte Phosphorylierung von ERK1/2, p38 und JNK, was mit der Glukokortikoid-Unterdrückung von MAPK24,25 oder mit der Verhinderung von Pyolysin-induzierten Schäden, wie durch die Verwendung des cholesterinabbauenden Wirkstoffs Methyl-β-Cyclodextrin nachgewiesen wurde, vereinbar ist36 . Darüber hinaus blieb Dexamethason zytoprotektiv, wenn die Zellen mit Pyolysin in Puffer mit hohem Kaliumgehalt zur Begrenzung des Kaliumausflusses (ergänzende Abbildung 5a) oder unter kalziumfreien Bedingungen zur Begrenzung des Kalziumeinstroms (ergänzende Abbildung 5b) herausgefordert wurden.

Repräsentativer Western-Blot von phosphoryliertem und gesamtem ERK1/2, p38 und JNK sowie α-Tubulin für HeLa-Zellen, behandelt mit Vehikel, 10 µM Dexamethason, 10 µM Hydrocortison oder 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) für 24 Stunden und dann 10 Minuten lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well Pyolysin herausgefordert. Densitometriedaten wurden auf α-Tubulin normalisiert und als Mittelwert + Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt; Die statistische Signifikanz wurde mittels ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test bestimmt.

Die Reduzierung des zellulären Cholesterins schützt die Zellen vor cholesterinabhängigen Cytolysinen und α-Hämolysin10,17,19. Wie erwartet reduzierte die 24-stündige Behandlung mit 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin das zelluläre Gesamtcholesterin in HeLa-Zellen (Abb. 6a), ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen (ergänzende Abb. 6a). Die Behandlung mit Dexamethason oder Hydrocortison führte jedoch nicht zu einer Senkung des Gesamtcholesterins der HeLa-Zellen (Abb. 6a). In A549-Zellen erhöhten die Glukokortikoide sogar den Cholesterinspiegel der A549-Zellen (ergänzende Abbildung 6b).

a-HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel, 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD), Dexamethason oder Hydrocortison behandelt und das gesamte zelluläre Cholesterin gemessen. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Dunnett bestimmt. b HeLa-Zellen wurden 16 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM SZ5-035 kultiviert, bevor sie 24 Stunden lang mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 ng/ml 27-Hydroxycholesterin (27-HC) behandelt wurden, wobei weiterhin Vehikel oder SZ5 vorhanden war -035; Anschließend wurde die Probe 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin behandelt und die LDH-Leckage sowie die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der ANOVA mit dem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest bestimmt. c Repräsentativer Western-Blot der Pyolysin-Bindung und des α-Tubulins für HeLa-Zellen, die mit Vehikel, 10 µM Dexamethason, 10 µM Hydrocortison, 50 nM T0901317, 10 ng/ml 27-Hydroxycholesterin (27-HC) oder 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin behandelt wurden (MβCD) für 24 Stunden und dann mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin für 2 Stunden herausgefordert. Densitometriedaten (rechtes Feld) wurden auf α-Tubulin normalisiert und als Mittelwert + Standardabweichung aus 4 Experimenten dargestellt; Die statistische Signifikanz wurde mittels ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test bestimmt.

Cholesterinabhängige Cytolysine binden an einen labilen Pool zugänglichen Cholesterins in Plasmamembranen11,12. Dies ist wichtig, da Seitenketten-Hydroxycholesterine die Cholesterinveresterung über Acyl-Coenzym A:Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) stimulieren, um das über die Plasmamembran zugängliche Cholesterin zu reduzieren, was Makrophagen vor cholesterinabhängigen Cytolysinen schützt, ohne das gesamte zelluläre Cholesterin zu senken, und ACAT mit SZ58-035 hemmt verringert diesen Schutz37. Unter Verwendung von 27-Hydroxycholesterin als Positivkontrolle zur Reduzierung des zugänglichen Cholesterins37 stellten wir außerdem fest, dass die Kultivierung von HeLa-Zellen mit SZ58-035 den 27-Hydroxycholesterin-Zytoprotektionsschutz gegenüber einer anschließenden 2-stündigen Cytolysin-Exposition verringerte (Abb. 6b). Obwohl angenommen wird, dass Dexamethason auch ACAT38 stimuliert, veränderte die Kultivierung von HeLa-Zellen mit SZ58-035 den Dexamethason-Schutz gegen Pyolysin-induziertes LDH-Leckage oder Zytolyse nicht wesentlich (Abb. 6b).

In einem unabhängigen Ansatz untersuchten wir, ob Glukokortikoide das über die Plasmamembran zugängliche Cholesterin verändern, indem wir die Pyolysinbindung an HeLa-Zellen maßen11. Wir haben zunächst überprüft, dass die Behandlung von HeLa-Zellen mit einem Leber-X-Rezeptor-Agonisten (T0901317; Tocris, Abingdon, UK), 27-Hydroxycholesterin oder Methyl-β-Cyclodextrin die Pyolysin-Bindung verringert (Abb. 6c). Die Behandlung von Zellen mit Dexamethason oder Hydrocortison hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Pyolysinbindung. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die Glukokortikoid-Zytoprotektion nicht durch die Reduzierung des über die Plasmamembran zugänglichen Cholesterins vermittelt wurde.

Wir verwendeten in unseren Experimenten serumfreies Medium, um störende Auswirkungen von Serumcholesterin, Steroiden, kortikosteroidbindendem Globulin und LDH zu vermeiden und eine Serumaktivierung von Gen- und Zellsignalwegen zu vermeiden30,39. Tatsächlich wurde der Glukokortikoid-Zytoprotektionsschutz gegen Pyolysin durch Kultivierung von HeLa-Zellen in ≥ 6% fötalem Rinderserum (Abb. 7a) oder durch Kultivierung von A549-Zellen mit 10% Serum (ergänzende Abb. 7) verhindert. Sogar die Kultivierung von HeLa-Zellen mit 10 % Aktivkohle-entferntem Serum, das cholesterin- und steroidarm ist40, verhinderte den Zytoprotektionseffekt von Dexamethason gegen Pyolysin (Abb. 7b). Wenn darüber hinaus in serumfreiem Medium kultivierte HeLa-Zellen 24 Stunden lang mit Dexamethason behandelt wurden, wurde der Zytoprotektionsschutz aufgehoben, wenn ≥ 6 Stunden vor der Pyolysin-Exposition 10 % Serum hinzugefügt wurden (Abb. 7c; ANOVA, Dunnett-Post-hoc-Test, P < 0,05). Umgekehrt wurde der Zytoschutz wiederhergestellt, indem das Medium, das 10 % Serum und 10 µM Dexamethason enthielt, durch serumfreies Medium ohne Dexamethason für ≥ 8 Stunden vor einer Pyolysin-Exposition ersetzt wurde (Abb. 7d; ANOVA, Dunnett-Post-Hoc-Test, P <0, 05). Zusammenfassend liefern diese Daten Hinweise darauf, dass Serum die Glukokortikoid-Zytoprotektion gegen Pyolysin reversibel verringern kann.

a-HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 10 µM Dexamethason in Medium behandelt, das die angegebenen Serumkonzentrationen enthielt, dann 2 Stunden lang mit 100 HU/Well Pyolysin belastet und die Lebensfähigkeit der Zellen durch MTT-Assay quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der ANOVA bestimmt. b HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason in Medium mit oder ohne 10 % gestripptem Serum behandelt, dann 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der ANOVA mit dem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest bestimmt. c HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason in Medium behandelt, das zum angegebenen Zeitpunkt mit 10 % Serum ergänzt war, bevor sie 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet wurden, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde quantifiziert. Bei den Daten handelt es sich um die prozentuale Lebensfähigkeit der Kontrollherausforderung, die Punkte stellen Einzelwerte aus 4 unabhängigen Experimenten dar und die Linie ist die Anpassung der kleinsten Quadrate. d HeLa-Zellen wurden mit 10 µM Dexamethason in Medium mit oder ohne 10 % Serum behandelt, dann wurden die Überstände zu den angegebenen Zeitpunkten verworfen und das Medium für den Rest der 24 Stunden auf serumfreies Medium umgestellt, bevor die Zellen damit herausgefordert wurden Kontrolle oder 100 HU/Well Pyolysin für 2 Stunden und Zelllebensfähigkeit quantifiziert. Bei den Daten handelt es sich um Prozentsätze lebensfähiger Zellen im Vergleich zur Kontrollherausforderung, Punkte stellen Einzelwerte aus drei unabhängigen Experimenten dar und Linien sind Anpassungen der kleinsten Quadrate.

Als nächstes untersuchten wir, ob der Glukokortikoidrezeptor für den Zytoprotektionsschutz wichtig ist, da Glukokortikoide auch Transkriptionsfaktoren unterdrücken und nichtgenomische Wirkungen ausüben können24,25,26,27. Die Kultivierung von HeLa- oder A549-Zellen mit dem Glukokortikoidrezeptor-Antagonisten RU48641 verringerte den Zytoprotektionsschutz von Dexamethason und Hydrocortison gegen Pyolysin (Abb. 8a, b; ergänzende Abb. 8). In ähnlicher Weise verringerte die Verwendung von siRNA, die auf NR3C1 abzielt, um den Glukokortikoidrezeptor in HeLa-Zellen abzubauen (Abb. 8c), den Zytoprotektionsschutz von Dexamethason und Hydrocortison gegen Pyolysin (Abb. 8d). Zusammengenommen liefern diese Experimente den Beweis, dass der Zytoschutz von Dexamethason und Hydrocortison gegen Pyolysin vom Glukocorticoidrezeptor abhängig war.

a HeLa-Zellen wurden mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason oder b 10 µM Hydrocortison in Medium mit oder ohne 10 µM RU486 24 Stunden lang behandelt, dann 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin belastet und LDH-Austritt und Zelllebensfähigkeit ermittelt quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung von 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA und des Bonferroni-Post-hoc-Tests bestimmt. c Western Blots von Glukokortikoidrezeptor (GR) und α-Tubulin für HeLa-Zellen, transfiziert mit durcheinandergemischter siRNA oder siRNA, die auf NR3C1 abzielt; Die Bilder sind repräsentativ für 4 unabhängige Experimente. d HeLa-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Scramble-siRNA oder siRNA, die auf NR3C1 abzielte, transfiziert, 24 Stunden lang mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 µM Hydrocortison behandelt, dann 2 Stunden lang mit Kontrolle oder 100 HU/Well-Pyolysin herausgefordert und LDH-Leckage und Zelle Lebensfähigkeit quantifiziert. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA und des Bonferroni-Post-hoc-Tests bestimmt.

Schließlich überlegten wir, ob der Zytoprotektionseffekt gegen Pyolysin möglicherweise davon abhängt, dass der Glukokortikoidrezeptor ein bestimmtes Gen aktiviert, da der Zytoprotektionsmechanismus eine Behandlung mit Dexamethason für ≥ 6 Stunden erforderte (Abb. 1g) und der Zytoprotektionsschutz ausgeschlossen war, wenn Zellen mit Actinomycin kultiviert wurden, um die Gentranskription zu hemmen (Abb. 9a). ) oder mit Cycloheximid zur Hemmung der Translation (Abb. 9b). Da das Serum die Zytoprotektion durch Glukokortikoide reversibel verhinderte, durchsuchten wir die Literatur nach Genen, die durch Glukokortikoide und Serum in entgegengesetzter Weise reguliert werden. Obwohl Glukokortikoide und Serum zahlreiche Gene 26, 30, 39 regulieren, haben wir 19 Gene identifiziert, die sowohl durch Dexamethason als auch durch Serum reguliert werden, von denen nur 11 gegensätzlich reguliert wurden (Ergänzungstabelle 1). Während es mechanistisch unwahrscheinlich schien, dass die meisten dieser Gene zur Zytoprotektion beitragen, war HMGCR ein potenzieller Kandidat, der das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im Mevalonat-Weg für die Cholesterinbiosynthese kodiert42. Glukokortikoide erhöhen die Expression von HMGCR, während Serum die Expression von HMGCR43 reduziert. Die Verwendung von siRNA zur gezielten Ausrichtung auf HMGCR in HeLa-Zellen verringerte den Zytoprotektionsschutz von Dexamethason gegen Pyolysin (Abb. 9c, ergänzende Abb. 9). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass der Dexamethason-Zytoprotektion zumindest teilweise von HMGCR abhängt.

a HeLa-Zellen wurden in Medium oder mit 1 µg/ml Cycloheximid oder b 0,25 µg/ml Actinomycin D kultiviert und 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt und dann 2 Stunden lang mit Kontrollmedium oder 100 HU Pyolysin belastet. Das Austreten von LDH in die Überstände wurde nach 2 Stunden gemessen und lebensfähige Zellen durch MTT-Assay bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Bonferroni-Mehrfachvergleichstest bestimmt. c HeLa-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Scramble-siRNA oder siRNA, die auf HMGCR abzielte, transfiziert, 24 Stunden lang mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt und dann 2 Stunden lang mit Kontrollmedium oder 100 HU Pyolysin belastet. Das Austreten von LDH in die Überstände wurde nach 2 Stunden gemessen und lebensfähige Zellen durch MTT-Assay bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA und des Bonferroni-Mehrfachvergleichstests bestimmt.

Wir fanden Hinweise auf eine bisher nicht identifizierte zytoprotektive Wirkung von Glukokortikoiden gegen porenbildende Toxine. Pyolysin, Streptolysin O und α-Hämolysin bildeten Poren in HeLa-Zellplasmamembranen, was durch das Austreten von Kalium und LDH aus den Zellen, die Aktivierung der MAPK-Stressreaktion, Veränderungen der Zellform und des Zytoskeletts sowie die Induktion der Zytolyse bestimmt wurde. Diese Beobachtungen sind typisch für die Auswirkungen porenbildender Toxine auf Zellen1,2,7,15,34. Wir fanden jedoch heraus, dass die Behandlung von HeLa-Zellen mit Dexamethason oder Hydrocortison den Cytolysin-induzierten Kalium- und LDH-Austritt verringerte, die Pyolysin-induzierte Phosphorylierung von ERK, p38 und JNK verhinderte, Veränderungen des Zytoskeletts begrenzte und die Zytolyse verhinderte. Anhand unserer LDH-Leckagedaten schätzen wir den EC50-Wert für den Schutz der HeLa-Zellen vor Pyolysin auf 0,09 µM Dexamethason. Der Grad der Zytoprotektion war bemerkenswert: 10 µM Dexamethason boten einen Schutz von > 90 %.

Der Glukokortikoid-Zytoprotektionsschutz gegen Pyolysin erstreckte sich auf mehrere Arten von Gewebezellen, der Grad des Zytoprotektionsmechanismus variierte jedoch zwischen den Zelltypen. Diese Variation in der Zytoprotektion könnte auf Unterschiede in den Glukokortikoidreaktionen zurückzuführen sein, die häufig zelltyp- und kontextspezifisch sind24,25,26,27. Alternativ könnte die Variation in der Zytoprotektion Unterschiede in der Zellempfindlichkeit gegenüber Pyolysin widerspiegeln, die bereits bei verschiedenen Zelllinien sowie zwischen Epithel- und Stromazellen festgestellt wurde10,36. Wir fanden auch Unterschiede in der Zytoprotektion zwischen den cholesterinabhängigen Zytolysinen und α-Hämolysin, was möglicherweise auf den mehr als zehnfach kleineren Durchmesser der α-Hämolysin-Poren zurückzuführen ist14,18.

Unter Schutz versteht man die Verteidigung oder den Schutz vor Angriffen, Verletzungen oder Schäden. Während die Reparatur das Ersetzen oder Reparieren beschädigter, abgenutzter oder fehlerhafter Strukturen umfasst. Zu den anerkannten Reparaturmechanismen für Zellen, die durch porenbildende Toxine geschädigt wurden, gehören Endozytose, Exozytose, MAPK, die entfaltete Proteinantwort und Caspase-Aktivität2,15,22,35. Diese Mechanismen werden normalerweise durch Kaliumausfluss oder Kalziumeinstrom ausgelöst, aber der Glukokortikoid-Zytoprotektionseffekt hing in der vorliegenden Studie nicht von den Kalium- oder Kalziumkonzentrationen ab. Darüber hinaus unterdrücken Glukokortikoide die MAPK-Phosphorylierung;25,39 wohingegen die Aktivierung von MAPK mit einer Verringerung der durch porenbildende Toxine verursachten Schäden verbunden ist15,34,35. Im Einklang mit der Tatsache, dass Glukokortikoide die Bildung von Aktin-Stressfasern stimulieren und das Zytoskelett stabilisieren44, haben wir auch festgestellt, dass Glukokortikoide die Bildung von Aktin-Stressfasern in HeLa- und A549-Zellen stimulieren. Diese Veränderungen könnten Cytolysin-induzierte Veränderungen des Zytoskeletts begrenzen; Allerdings ist unklar, wie dies das Austreten von Kalium oder LDH begrenzen würde. Tatsächlich war ein bemerkenswertes Merkmal, dass Pyolysin an Zellen gebunden war, aber die Behandlung mit Dexamethason schien die Bildung von Poren zu begrenzen, was durch das Austreten von Kalium oder LDH festgestellt wurde. Die Fähigkeit der Glukokortikoidbehandlung, den Cytolysin-induzierten Kaliumverlust zu begrenzen, impliziert, dass die frühen Stadien der Porenbildung sowie die späteren Stadien der Membranschädigung und Zytolyse verhindert wurden, was durch den LDH-Austritt nachgewiesen wurde.

Der Zytoschutz von Dexamethason gegen Pyolysin war unerwartet, da Glukokortikoide im Gegensatz zu Statinen, Interferonen, Oxysterolen oder Cyclodextrinen, die zur Begrenzung der Zellschädigung oder Bindung von cholesterinabhängigen Cytolysinen eingesetzt werden, keine anerkannten cholesterinsenkenden Mittel sind10,11,12,19,29, 37,45. Es gibt einen Pool an labilem Cholesterin, der für cholesterinabhängige Zytolysine zugänglich ist, wenn Cholesterin > 35 Mol-% der Membranlipide ausmacht11,12,37. Veränderungen in der Cholesterinsynthese, -aufnahme, -ausleitung oder im Metabolismus verändern die Fähigkeit cholesterinabhängiger Cytolysine, sich an Zellen zu binden. In der vorliegenden Studie stellten wir jedoch fest, dass Glukokortikoide weder das gesamte zelluläre Cholesterin noch den zugänglichen Pool an Plasmamembrancholesterin senkten. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen überein, dass Dexamethason die Cholesterinsynthese stimuliert und den zellulären Cholesterinausfluss unterdrückt46. Obwohl Dexamethason ACAT stimulieren kann38, fanden wir auch heraus, dass Glukokortikoide im Gegensatz zu Hydroxycholesterinen in der Seitenkette37 die Zellen nicht signifikant durch eine Erhöhung der Cholesterinveresterung schützten. Wir gehen daher davon aus, dass ein verringertes Cholesterin in der Plasmamembran wahrscheinlich kein Mechanismus für den Glukokortikoid-Zytoprotektionsmechanismus ist. Andere Veränderungen in der Plasmamembran könnten jedoch die Porenbildung verhindern, ohne das gesamte zelluläre Cholesterin zu verändern. Interessanterweise erhöht Cortisol die Fluidität der Hepatozyten-Plasmamembran und verändert die Membranordnung bei Regenbogenforellen47. Die Packung der Phospholipide in Plasmamembranen verändert die Verteilung und Zugänglichkeit von Cholesterin, und eine weniger dichte Packung der Phospholipide kann genutzt werden, um die cholesterinabhängige Bindung zu fördern48,49. Solche Veränderungen in der Lipidordnung haben auch umfassendere Auswirkungen auf die Empfindlichkeit von Membranen gegenüber Schäden. Beispielsweise trägt eine hohe Lipidordnung in Killer-T-Zellen dazu bei, die Plasmamembran vor Schäden zu schützen, indem sie das porenbildende Wirtstoxin Perforin50 abwehrt.

Obwohl Glukokortikoide Transkriptionsfaktoren unterdrücken und schnelle nichtgenomische Wirkungen haben können, wirken sie normalerweise durch Bindung an den Glukokortikoidrezeptor im Zytosol24,25,26,27. Der Rezeptor bewegt sich dann zum Zellkern und bindet Glukokortikoid-Reaktionselemente, was zur Transaktivierung oder Transrepression von Genen führt. Wir gingen davon aus, dass der Zytoprotektionsmechanismus wahrscheinlich ein vom Glukokortikoidrezeptor abhängiger Effekt ist, da die Zytoprotektion eine Glukokortikoidbehandlung für ≥ 6 Stunden erforderte und die Hemmung der Transkription oder Translation die Zytoprotektion verringerte. Der Glukokortikoidrezeptor-Inhibitor RU486 verringerte auch die Zytoprotektion durch Dexamethason. Eine Sorge könnte sein, dass RU486 auch eine Anti-Progestin-Aktivität aufweist, HeLa-Zellen jedoch den Progesteronrezeptor nicht exprimieren51. Darüber hinaus verringerte die Verwendung von siRNA, die auf NR3C1 abzielt, um das Glukokortikoidrezeptorprotein zu reduzieren, den Zytoprotektionsschutz von Dexamethason. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse den Beweis, dass der Glukokortikoid-Zytoprotektionsschutz gegen porenbildende Toxine vom Glukokortikoidrezeptor abhängig war.

Glukokortikoide werden als Zusatztherapie bei einigen bakteriellen Infektionen eingesetzt, da sie Entzündungen und Immunpathologien reduzieren6,24,25. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Glukokortikoide auch prophylaktisch vor Gewebeschäden schützen könnten, die durch Bakterien verursacht werden, die porenbildende Toxine absondern. Eine zukünftige Herausforderung wird darin bestehen, die entzündungshemmende und schützende Rolle von Glukokortikoiden zu entwirren. Eine weitere Herausforderung besteht darin, dass Glukokortikoide möglicherweise auch die Hungerreaktionen in den Zellen verändert haben, um deren Anfälligkeit für porenbildende Toxine zu beeinflussen. Mithilfe von MTT-Tests, zellulären DNA-Tests oder Zytologie konnten wir keine Hinweise darauf finden, dass die Behandlung mit Glukokortikoiden die Anzahl lebensfähiger Zellen mit oder ohne Serum verändert. Unser unerwarteter Befund, dass die Kultivierung von Zellen mit Serum die Glukokortikoid-Zytoprotektion reversibel verringert, inspirierte jedoch zu einer Suche nach Faktoren, die durch Serum und Glukokortikoide in entgegengesetzter Weise reguliert werden. Obwohl Serum und Glukokortikoide ein breites Spektrum an Genen und Signalwegen regulieren25,26,30, werden nur wenige unterschiedlich reguliert. Ein Beispiel war, dass die HMGCR-Expression durch Serumbehandlung unterdrückt wird30, wohingegen Glukokortikoide die HMGCR-Aktivität in HeLa-Zellen erhöhen43. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die Verwendung von siRNA zum Abbau von HMGCR die Glukokortikoid-Zytoprotektion gegen Pyolysin verringerte. Wie HMGCR Glukokortikoide mechanistisch mit Zytoprotektion verknüpft, bedarf weiterer Untersuchungen.

Ob in vivo eine Zytoprotektion durch Glukokortikoide erkennbar ist, bedarf weiterer Untersuchungen. Eine potenzielle Einschränkung für die Umsetzung unserer Ergebnisse besteht darin, dass eine kurzfristige Glukokortikoidbehandlung zwar von Patienten gut vertragen wird, eine längere Anwendung oder hohe Dosen von Glukokortikoiden jedoch mit unerwünschten endokrinen oder immunsupprimierenden Nebenwirkungen verbunden sind25. Dies hat zur Entwicklung selektiver Glukokortikoidrezeptor-Agonisten wie Fluticason mit einer hohen Affinität zum Glukokortikoidrezeptor und verbesserten entzündungshemmenden Wirkungen geführt28. Unsere Ergebnisse könnten nun die Suche nach selektiven Glukokortikoidrezeptor-Agonisten anregen, die auch die Zytoprotektion verbessern, was dazu beitragen würde, dass Patienten Krankheitserreger besser vertragen20.

Zusammenfassend stellten wir fest, dass die Behandlung mit Glukokortikoiden mehrere Zelltypen vor porenbildenden Toxinen schützte. Glukokortikoide erhöhten den zelleigenen Schutz von HeLa und A549 vor Schäden und Zytolyse durch Pyolysin, Streptolysin O und α-Hämolysin. Diese Glukokortikoid-Zytoprotektion hing vom Glukokortikoidrezeptor ab. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Glukokortikoide genutzt werden könnten, um Gewebe dabei zu helfen, das Vorhandensein pathogener Bakterien, die porenbildende Toxine absondern, besser zu tolerieren.

Menschliche zervikale epitheliale HeLa-Zellen (CCL2, 93021013; European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC), Public Health England, Salisbury, UK) wurden in komplettem Medium bestehend aus DMEM (Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK), 10 % Hitze- inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS, Biosera, East Sussex, UK), 2 mM L-Glutamin (Thermo Fisher Scientific) und 1 % antibiotische, antimykotische Lösung (ABAM; Merck, Gillingham, UK). Menschliche Lungenepithel-A549-Zellen (CCL-185; ATCC, Middlesex, UK) wurden in Komplettmedium bestehend aus RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin (Thermo Fisher Scientific) und 1 % ABAM kultiviert. Menschliche Leberepithel-HepG2-Zellen (HB-8065; ATCC) wurden in Komplettmedium bestehend aus DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % ABAM kultiviert. Menschliche Lungenepithel-NCI-H441-Zellen (HTB-174; ATCC) wurden in Komplettmedium bestehend aus RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % ABAM kultiviert.

Primäre normale menschliche Hautfibroblasten (C-12302; Promocell, Heidelberg, Deutschland) wurden aus der Dermis normaler Erwachsenenhaut gewonnen. Die Zellen wurden in Fibroblasten-Wachstumsmedium 2 mit Ergänzungsmischung (Promocell) kultiviert. Primäre normale menschliche Lungenfibroblasten wurden aus normalem, gesundem menschlichem Lungenparenchym gewonnen (HLF, PCS-201-013; ATCC). Die Zellen wurden in Komplettmedium kultiviert, das DMEM mit niedrigem Glucosegehalt (Thermo Fisher Scientific), 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % ABAM enthielt.

Normale menschliche Prostata-PNT2-Zellen (95012613; ECACC) wurden aus einem normalen Individuum isoliert und mit SV40 immortalisiert. Normale menschliche mesotheliale MET5A-Zellen (CRL-9444; ATCC) wurden aus Pleuraflüssigkeiten von nicht krebskranken Personen isoliert und mit dem pRSV-T-Plasmid immortalisiert. Beide Zellen wurden in Komplettmedium bestehend aus RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % ABAM kultiviert.

Erwachsene primäre menschliche Chondrozyten wurden aus überschüssigem nasoseptalen chirurgischen Gewebe isoliert, das mit Einverständniserklärung gesunder Spender gesammelt wurde, die sich einer Septorhinoplastik in den Krankenhäusern Singleton und Morriston, Swansea, Großbritannien, unterzogen hatten, mit Genehmigung des Swansea Bay University Health Board (IRAS ID 99202). Primäre menschliche Chondrozyten wurden durch sequentiellen Verdau von nasoseptalem Knorpelgewebe mit 0,2 % (Gew./Vol.) Pronase (Merck) für 40 Minuten, gefolgt von 0,24 % (Gew./Vol.) Kollagenaselösung (Merck) für 16 Stunden und 52 Minuten isoliert. Die Zellen wurden in Komplettmedium kultiviert, das DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM D-Glucose, 0,1 % MEM NEAA (Merck) und 1 % ABAM enthielt.

Primäre bovine Endometriumepithelzellen wurden aus normalen weiblichen Genitaltrakten isoliert, die von Rindern gesammelt wurden, nachdem diese während der normalen Arbeit eines kommerziellen Schlachthofs geschlachtet wurden, mit Genehmigung des Ministeriums für Umwelt, Ernährung und ländliche Angelegenheiten des Vereinigten Königreichs gemäß der Verordnung über tierische Nebenprodukte ( (EG) Nr. 1069/2009 (Registrierungsnummer U1268379/ABP/OTHER). Kurz gesagt, Epithelzellen wurden isoliert, indem das Endometrium präpariert und gehacktes Gewebe eine Stunde lang bei 37 °C unter leichtem Rühren in einer Verdauungslösung (375 BAEE-Einheiten Trypsin, Ethylendiamintetraessigsäure, 50 mg Kollagenase II, 100 mg Rinderserumalbumin (BSA)) inkubiert wurde ) und 10 mg DNase I in 100 ml ausgewogener Hanks-Salzlösung; alle Merck)10. Die resultierende Zellsuspension wurde durch ein 40-μm-Netz (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) gesiebt und die Epithelzellen wurden dann durch Rückspülen des Netzes gesammelt. Die Endometriumepithelzellen wurden in Komplettmedium bestehend aus RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % ABAM kultiviert.

Die Zellen wurden in 75-cm2-Kolben (Greiner Bio-One) bei 37,5 °C in feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid kultiviert und das Medium alle 48–72 Stunden aufgefüllt. Für Experimente wurden Zellen in 24-Loch-Gewebekulturplatten (TPP, Trasadingen, Schweiz) unter Verwendung von 1 ml/Loch Komplettmedium ausgesät und bis zur 70 %igen Konfluenz kultiviert.

Pyolysin-Protein (628.338 HU/mg Protein) wurde aus dem plo-Plasmid pGS5910,13 erzeugt und gereinigt. Streptolysin O wurde als 1 mg/ml-Lösung gelagert und mit 10 mM Dithiothreitol aktiviert, und Staphylococcus aureus α-Hämolysin wurde als 0,5 mg/ml-Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers (alle Merck) gelagert.

Die Pyolysin-Challenge-Konzentrationen wurden bestimmt, indem die Zellen 24 Stunden lang in serumfreiem Medium kultiviert und dann 15 Minuten lang mit 12,5–400 HU Pyolysin in 200 µl/Well Dulbecco's PBS (DPBS, Thermo Fisher Scientific) getestet wurden, das dann mit 400 µl ergänzt wurde /Well serumfreies Medium für 1 Stunde 45 Minuten. Am Ende des Belastungszeitraums wurden Überstände gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT-Assays gemessen.

Um zu untersuchen, ob Glukokortikoide die Zellen vor Pyolysin schützen, wurden die Zellen in serumfreien Medien mit 0,1 % DMSO-Vehikel oder dem in „Ergebnisse von Dexamethason (#D4902; Merck), Hydrocortison (#H0888; Merck) oder Fluticasonpropionat angegebenen Konzentrationsbereich“ inkubiert (#2007; Tocris, Abingdon, UK), die auf den Anweisungen und Veröffentlichungen der Hersteller basierten28,53,54. Der 24-stündige Behandlungszeitraum basierte auf Arbeiten zur Untersuchung des Zytoprotektionsschutzes;10,19,31 mit Ausnahme von Experimenten zur Untersuchung der Dauer der Glukokortikoidbehandlung, die zum Schutz der Zellen vor porenbildenden Toxinen erforderlich ist, wobei HeLa-Zellen über einen bestimmten Zeitraum mit 10 µM Dexamethason oder Hydrocortison behandelt wurden von Zeiten bis zu 24 Stunden. Nach dem Behandlungszeitraum wurden die Überstände verworfen und die Zellen wurden mit Kontrolle oder Pyolysin belastet, wie in den Ergebnissen angegeben. Um festzustellen, ob die Zytoprotektion über Pyolysin hinausging, wurden HeLa- und A549-Zellen 24 Stunden lang mit Dexamethason behandelt und dann 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Streptolysin O oder 24 Stunden lang mit α-Hämolysin belastet, wie in den Ergebnissen angegeben. Der Konzentrationsbereich der α-Hämolysin-Provokation basierte auf früheren Arbeiten32 und die 24-Stunden-Dauer wurde nach vorläufigen Experimenten ausgewählt. Am Ende der Belastungsperioden wurden Überstände gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT-Assay bewertet, oder es wurden Durchlichtmikroskopaufnahmen mit einer Axiocam ERc 5s-Mikroskopkamera (Zeiss) aufgenommen und der Anteil an normalem, blasenbildendem und Fragmentierte Zellen wurden unter Verwendung von zwei unabhängigen Bildern pro Behandlungsreplikation gezählt.

Um die Auswirkungen der Glukokortikoidbehandlung auf die Pyolysin-induzierte MAPK-Signalübertragung zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen 24 Stunden lang mit 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung auf Platten mit 6 Vertiefungen in Komplettmedium ausgesät und dann mit serumfreiem Medium oder Medium, das 10 µM Dexamethason enthielt, behandelt , 10 µM Hydrocortison oder 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (Merck) für 24 Stunden und dann 10 Minuten lang mit serumfreiem Kontrollmedium oder Medium, das 100 HU/Well Pyolysin enthält, belastet. und MAPK, ausgewertet durch Western Blot (siehe unten).

Um die Wirkung von Kalium auf den Zytoprotektionsschutz zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen 24 Stunden lang in Medium mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason kultiviert, die Zellen wurden zweimal mit Puffer gewaschen und dann mit 100 HU/Well Pyolysin in 200 µl/Well mit niedrigem Kaliumgehalt behandelt Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,36 mM K2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 5,5 mM D-Glucose, 4,2 mM NaHCO3) oder Puffer mit hohem Kaliumgehalt (5 mM NaCl, 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,36 mM K2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 5,5 mM D-Glucose, 4,2 mM NaHCO3) für 2 Stunden21. Um die Wirkung von Kalzium auf den Zytoschutz zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen 24 Stunden lang in Medium mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason kultiviert, die Zellen wurden zweimal mit kalziumfreiem DPBS gewaschen und dann mit 100 HU/Vertiefung Pyolysin in 200 µl/Vertiefung belastet Kalziumfreies oder kalziumhaltiges DPBS für 15 Minuten, ergänzt mit 400 µl serumfreiem Medium mit oder ohne Kalzium für 1 Stunde und 45 Minuten. Überstände wurden gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT-Assays gemessen.

Um die Rolle von ACAT bei der Glukokortikoid-Zytoprotektion gegen Pyolysin zu untersuchen, verwendeten wir den selektiven ACAT-Inhibitor Sandoz 58-035 (SZ58-035, Merck)37,55. HeLa-Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Thermo Fisher Scientific) gewaschen und dann mit 0,1 % DMSO-Vehikel oder 10 µM SZ5-035 in serumfreiem Kulturmedium kultiviert. Nach einer 16-stündigen Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann 24 Stunden lang in serumfreiem Kulturmedium inkubiert, das 10 ng/ml 27-Hydroxycholesterin (Avanti Polar Lipids, Alabama, USA) oder 10 µM Dexamethason in Kombination mit enthielt Fahrzeug oder 10 µM SZ5-035. Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin in Kontakt gebracht, und dann wurden die Überstände gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT-Assays gemessen.

Um die Wirkung der Glukokortikoidbehandlung auf die Häufigkeit von membrangebundenem Pyolysin zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen mit 1,5 × 105 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 6 Vertiefungen in Vollmedium für 24 Stunden ausgesät und dann in serumfreiem Medium oder Medium, das es enthielt, behandelt 10 µM Dexamethason, 10 µM Hydrocortison, 50 nM T0901317, 10 ng/ml 27 Hydroxycholesterin oder 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin für 24 Stunden und dann 2 Stunden lang mit serumfreiem Kontrollmedium oder Medium, das 100 HU/Well Pyolysin enthält, belastet und Pyolysin-Bindung bestimmt durch Western Blot.

Um die Wirkung von Serum auf den Zytoprotektionsschutz zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen für die in den Ergebnissen angegebene Zeitspanne mit Dexamethason in einem Medium behandelt, das hitzeinaktiviertes FBS oder mit Aktivkohle befreites hitzeinaktiviertes FBS enthielt. Um zu untersuchen, ob die Auswirkungen des Serums auf den Zytoprotektionsschutz reversibel waren, wurden die Zellen mit 10 µM Dexamethason in Medium mit oder ohne 10 % FBS behandelt und dann zu verschiedenen Zeitpunkten von 1 bis 24 Stunden die Überstände verworfen und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen , und das Medium wurde für den Rest des 24-Stunden-Zeitraums auf serumfreies Medium umgestellt, bevor die Zellen 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin belastet wurden und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines MTT-Assays gemessen wurde.

Um die Rolle des Glukokortikoidrezeptors bei der Zytoprotektion zu untersuchen, verwendeten wir die Inhibitoren Actinomycin D, Cycloheximid und RU486 (alle Merck). Die Zellen wurden in serumfreiem Medium mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 µM Hydrocortison in Kombination mit 0,1 % DMSO-Lösungsmittel, 10 µM RU486 oder 1 µg/ml Cycloheximid inkubiert, wie in den Ergebnissen angegeben. Alternativ wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 0,15 % DMSO-Lösungsmittel oder 0,25 µg/ml Actinomycin D behandelt und dann 24 Stunden lang mit den Kombinationen aus Vehikel, 10 µM Dexamethason und Actinomycin D behandelt, wie in den Ergebnissen angegeben. Die Überstände wurden verworfen, die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin belastet, die Überstände wurden gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT-Assays gemessen.

Um die Rolle des Glukokortikoidrezeptors und des HMGCR bei der Zytoprotektion zu untersuchen, wurde siRNA verwendet, um die Expression von NR3C1 bzw. HMGCR zu unterdrücken. Die Zellen wurden mit Scramble ON-TARGET Plus Non-Targeting-siRNAs (#D-001810-0X; Horizon Discovery, Cambridge, UK) und ON-TARGET Plus SMART Pool-siRNAs mit Targeting auf NR3C1 (L-003424-00-0005; Horizon Discovery) transfiziert. oder siRNA, die mit dem Dharmacon siDesign Center entwickelt wurde, um auf HMGCR abzuzielen (sense, GGAUAAACCGAGAAAGAAAUU; antisense, UUUCUUUCUCGGUUUAUCC). In 24-Well-Kulturplatten wurden 50 pmol siRNA zu 100 µl/Well Opti-MEM 1-Medium mit 1,5 µl Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Thermo Fisher Scientific) gegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden HeLa-Zellen 48 Stunden lang mit 4 × 104 Zellen in 900 µl DMEM-Medium mit 10 % FBS ausgesät. Die Zellen wurden dann 24 Stunden lang mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 µM Hydrocortison in serumfreiem Kulturmedium behandelt, bevor sie 2 Stunden lang mit Kontrollmedium oder Medium, das 100 HU Pyolysin enthielt, ausgesetzt wurden. Am Ende des Belastungszeitraums wurden Überstände gesammelt, um die LDH-Leckage zu messen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe von MTT-Assays bewertet.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die mitochondrienabhängige Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, Merck)10,56 beurteilt. Die Zellen wurden 2 Stunden lang in serumfreiem Kulturmedium mit 250 µl/Vertiefung, das 1 mg/ml MTT enthielt, inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen und die Zellen wurden mit 300 µl/Vertiefung Dimethylsulfoxid (Merck) lysiert. Die optische Dichte (OD570) wurde mit einem POLARstar Omega-Mikroplattenlesegerät (POLARstar Omega; BMG, Labtech, Offenburg, Deutschland) gemessen. Die Lebensfähigkeit dermaler Fibroblasten wurde durch Quantifizierung der zellulären DNA mit dem CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet.

Die Aktivität der Laktatdehydrogenase wurde durch Messung der LDH-abhängigen Umwandlung von Laktat in Pyruvat über die Reduktion von Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) zu NADH quantifiziert, was durch die NADH-abhängige Reduktion eines Tetrazoliumsalzes zu Formazan nachgewiesen wird17. Kurz gesagt, 0–20 nmol/Well NADH-Standard (Merck) oder 20 µl/Well Zellüberstand wurden zu 30 µl/Well Assay-Puffer (0,2 M Tris-Hydrochlorid, pH 8,2, Merck) in zweifacher Ausfertigung in klaren 96-Well-Platten mit halber Fläche gegeben (Greiner). Eine Reaktionsmischung (54 mM Natrium-L-lactat, 0,66 mM 2-p-Iodphenyl-3-p-nitrophenyltetrazoliumchlorid, 0,28 mM Phenazinmethosulfat und 1,3 mM NAD+; alle Merck) wurde in Testpuffer hergestellt und 50 µl hinzugefügt jeder gut. Die optische Dichte bei 570 nm wurde sofort (A0) und nach 30-minütiger Inkubation bei 37,5 °C (A30) mit einem POLARstar Omega-Plattenlesegerät gemessen. Der Unterschied in der optischen Dichte des Überstands (A30 – A0) wurde verwendet, um die Menge an NADH zu berechnen, die aus den NADH-Standards erzeugt wurde. Die LDH-Aktivität des Überstands in mU/ml wurde dann wie folgt berechnet: LDH-Aktivität = nMol NADH / (30 Minuten Reaktionszeit × 0,02 ml Volumen Überstand). Die Variationskoeffizienten zwischen und innerhalb des Tests betrugen < 8 % bzw. < 5 %.

Um das Austreten von Kalium zu quantifizieren, wurden die Zellen in Vollmedium mit 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, bevor sie 24 Stunden lang mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 µM Hydrocortison in serumfreiem Medium behandelt wurden H. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden dreimal mit kaliumfreiem Cholinpuffer (129 mM Cholin-Cl, 0,8 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 5 mM Zitronensäure, 5,6 mM Glucose, 10 mM NH4Cl, 5 mM H3PO4, pH) gewaschen 7,4; alle Merck) und dann 5 Minuten lang mit Cholinpuffer, Pyolysin oder Streptolysin O oder 15 Minuten lang mit 8 µg/5 × 104 Zellen α-Hämolysin belastet (nach 5 Minuten α war kein Kaliumaustritt aus HeLa-Zellen nachweisbar -Hämolysin-Challenge). Anschließend wurden die Zellen dreimal in eiskaltem Cholinpuffer gewaschen und in 0,5 % Triton X-100 (Merck) in destilliertem Wasser 20 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur lysiert. Kalium wurde in Überständen und Lysaten mit einem Flammenphotometer Jenway PFP7 (Cole-Parmer, Stone, Staffordshire, UK) gemessen. Die Variationskoeffizienten zwischen und innerhalb des Tests betrugen < 4 %.

Um zelluläres Cholesterin in HeLa- und A549-Zellen zu quantifizieren, wurden 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung 24 Stunden lang auf Kulturplatten mit 6 Vertiefungen in Vollmedium ausgesät. Die Zellen wurden weitere 24 Stunden lang in serumfreiem Medium mit Vehikel, 10 µM Dexamethason, 10 µM Hydrocortison oder 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin behandelt, bevor die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 200 µl/Well Cholesterin-Assay-Puffer gesammelt wurden (Thermo Fisher Scientific) und bei −20 °C gelagert. Das zelluläre Cholesterin wurde mit dem Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt verwendet der Test Cholesterinesterase aus Pseudomonas, um Cholesterinester zu hydrolysieren, bevor Cholesterinoxidase aus Streptomyces zelluläres Cholesterin oxidiert, um Wasserstoffperoxid und Cholestenon zu ergeben. Das Amplex Red-Reagenz reagiert mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Meerrettichperoxidase und erzeugt fluoreszierendes Resorufin. Die Fluoreszenz wurde mit einem POLARstar Omega-Mikroplattenlesegerät unter Verwendung einer Anregung bei 530 nm und einer Emission bei 590 nm gemessen. Die Proteinhäufigkeit wurde in Proben mithilfe eines DC-Proteinassays (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen und die Cholesterinkonzentrationen wurden auf das gesamte zelluläre Protein normalisiert. Die Inter- und Intra-Assay-Variationskoeffizienten für den Assay betrugen < 6 % bzw. < 5 %.

Um die Verteilung der Aktinfilamente zu untersuchen, wurden die Zellen mit Alexa Fluor 555-konjugiertem Phalloidin (Thermo Fisher Scientific)16 gefärbt. Glasdeckgläser wurden mit 4 × 104 Zellen pro Vertiefung in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in Vollmedium für 24 Stunden ausgesät, bevor sie 24 Stunden lang in serumfreiem Medium mit Vehikel, 10 µM Dexamethason oder 10 µM Hydrocortison behandelt wurden. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin oder 24 Stunden lang mit α-Hämolysin belastet. Am Ende des Belastungszeitraums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 4 % Paraformaldehyd (Merck) fixiert, in PBS gewaschen und dann in 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Triton X-100 blockiert und dann 1 Stunde lang mit Alexa Fluor 555-konjugiertem Phalloidin (Thermo Fisher Scientific) inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit 0,1 % Triton Die Zellen wurden mit einem Axio Imager M1 Fluoreszenzmikroskop untersucht und Bilder mit einer AxioCamMR3 (Zeiss) aufgenommen. Der Anteil der Zellen, die nach der Pyolysin-Provokation Zytoskelettveränderungen (Zytoskelettkontraktion, gestörte Form oder Verlust der Aktinfaserdefinition) aufwiesen, wurde unter Verwendung von > 135 Zellen pro Behandlung über 3 unabhängige Bilder pro Replikat gezählt.

Um Veränderungen in der Zellform weiter zu untersuchen, wurden die Zellen mit der Plasmamembranfärbung CellMask Deep Red (Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Kurz gesagt, 4 × 104 HeLa-Zellen pro Vertiefung wurden auf Glasdeckgläsern in 24-Well-Kulturplatten in Vollmedium 24 Stunden lang kultiviert und dann 24 Stunden lang in serumfreiem Medium mit Vehikel oder 10 µM Dexamethason behandelt. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Kontrolle oder Pyolysin belastet. Am Ende des Belastungszeitraums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit CellMask Deep Red 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, erneut mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Deckgläser wurden mit 40,6-Diamidino-2-phenylindol auf Objektträger montiert, um Zellkerne sichtbar zu machen, und die Zellen wurden mit einem Axio Imager M1-Fluoreszenzmikroskop untersucht und Bilder mit einer AxioCamMR3 aufgenommen.

Am Ende der Experimente wurden die Überstände verworfen, die Zellen mit 300 μl eiskaltem PBS gewaschen und mit 100 μl PhosphoSafe-Extraktionsreagenz (Novagen, Darmstadt, Deutschland) für die anschließende Proteinisolierung und den Western Blot lysiert31. Das Protein wurde mithilfe eines DC-Assays extrahiert und quantifiziert, und 10 μg/Spur-Protein wurden mithilfe einer 10 % (Vol./Vol.) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine ​​auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (GE Healthcare, Chalfont, St Giles, UK) übertragen und 1 Stunde lang in Tris-gepufferter Tween 20-Kochsalzlösung (TBST, Merck) mit 5 % BSA blockiert. Die Membranen wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert, die 1:1000 (oder wie angegeben) in Blockierungspuffer verdünnt waren. Die primären Antikörper waren diphosphoryliertes ERK1/2 (RRID: AB_477245; Merck), ERK1/2 (RRID: AB_2297336; Abcam, Cambridge, UK), Phospho-p38 (RRID: AB_2139682, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p38 (RRID: AB_10999090, Zellsignalisierung), Phospho-JNK (RRID: AB_331659; Zellsignalisierung), JNK (RRID: AB_2250373; Zellsignalisierung), α-His-Pyolysin-Antikörper13 (1:500-Verdünnung), Glukokortikoidrezeptor (RRID: AB_2631286, Cell Signaling), HMGCR (RRID: AB_2749818, Abcam, Cambridge, UK) oder α-Tubulin (RRID: AB_2210548; Cell Signaling). Die Membranen wurden dann fünfmal in TBST gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1:2500 verdünntem Anti-Kaninchen-IgG (RRID:AB_2099233; Cell Signalling) oder Anti-Maus-IgG (RRID:AB_330924; Cell Signalling) in TBST mit 5 inkubiert % BSA. Die Membranen wurden weitere fünf Mal in TBST gewaschen und die Proteinreaktivität wurde mithilfe verstärkter Chemilumineszenz (Clarity Western ECL-Substrat, Bio-Rad) sichtbar gemacht. Membranbilder (ergänzende Abbildung 10) wurden mit einem ChemiDoc XRS-System (Bio-Rad) aufgenommen und die durchschnittliche Peakdichte der Banden wurde quantifiziert und mit Fiji57 auf α-Tubulin normalisiert.

Die statistische Einheit war jede unabhängige Zellpassage. Die Daten werden als arithmetisches Mittel ± Standardabweichung angegeben, wobei die Signifikanz zugeschrieben wird, wenn P < 0,05. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.0.1 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA) und SPSS Version 26.0 (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt. Vergleiche zwischen Behandlungen wurden mithilfe der ANOVA durchgeführt, gefolgt von Post-hoc-Tests für mehrere Vergleiche, wie in den Ergebnissen angegeben. Die Proportionen wurden mit dem Chi-Quadrat-Test verglichen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sowie nicht beschnittene Western Blots sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind in den Zusatzdaten 1 verfügbar. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/K006592/1) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health (R01HD084316) unterstützt. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Das plo-Plasmid (pGS59) und der Pyolysin-Antikörper waren großzügige Geschenke von H. Jost (Universität von Arizona, USA). Wir danken I Whitaker für Chondrozyten und A Horlock und M Pospiech (University of Swansea) für technische Beratung.

Medizinische Fakultät der Swansea University, Swansea University, Swansea, SA2 8PP, Großbritannien

Thomas JR Ormsby, Sian E. Owens, Matthew L. Turner, James G. Cronin und I. Martin Sheldon

Abteilung für Tierwissenschaften, University of Florida, Gainesville, FL, 32611, USA

John J. Bromfield

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Konzeptualisierung, IMS, TO; Methodik, IMS, TO, SEO, MLT; Untersuchung TO, SEO, MLT; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung TO, IMS; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten von TO, SEO, MLT, JGC, JJB, IMS; Visualisierung ZU, IMS; Aufsicht, IMS, JGC, JJB; Projektverwaltung IMS; Finanzierungseinwerbung IMS, JJB

Korrespondenz mit I. Martin Sheldon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Erwachsene primäre menschliche Chondrozyten wurden aus überschüssigem nasoseptalen chirurgischen Gewebe isoliert, das mit Einverständniserklärung gesunder Spender gesammelt wurde, die sich einer Septorhinoplastik in den Krankenhäusern Singleton und Morriston, Swansea, Großbritannien, unterzogen hatten, mit Genehmigung des Swansea Bay University Health Board (IRAS ID 99202). Primäre bovine Endometriumepithelzellen wurden aus weiblichen Genitaltrakten isoliert, die von Rindern gesammelt wurden, nachdem diese während der normalen Arbeit eines kommerziellen Schlachthofs geschlachtet wurden, mit Genehmigung des Ministeriums für Umwelt, Ernährung und ländliche Angelegenheiten des Vereinigten Königreichs gemäß der Verordnung über tierische Nebenprodukte (EG). ) Nr. 1069/2009 (Registrierungsnummer U1268379/ABP/OTHER).

Communications Biology dankt Michelle Christie und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Jesmond Dalli und Eve Rogers.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ormsby, TJR, Owens, SE, Turner, ML et al. Glukokortikoide erhöhen den Schutz der Gewebezellen vor porenbildenden Toxinen pathogener Bakterien. Commun Biol 6, 186 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04568-w

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Eingegangen: 15. Juli 2021

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04568-w

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